ウェスタンブロッティング・プロトコール
培養細胞および組織サンプルの化学発光および蛍光検出によるウェスタンブロッティングの包括的な手順をご覧いただけます。
その他のプロトコール
その他のプロトコール
ウェスタンブロッティング用一次抗体のラインナップを見る
ウェスタンブロッティング用二次抗体のラインナップを見る
ウェスタンブロッティングは、複雑なサンプル中の特定のタンパク質を検出するために広く使用されている技術です。 ウェスタンブロッティング手順は、タンパク質分離から検出までのすべてのステップを含む、このプロトコールで説明されている包括的なプロセスを指します。
本プロトコールでは、化学発光法または蛍光法を用いたサンプル調製から検出までのワークフロー全体について概説します。 これには、ライセート調製、ゲル電気泳動、膜へのタンパク質転写、抗体インキュベーション、およびイメージングの詳細なステップが含まれます。
この方法は、SDS-PAGEを使用してタンパク質をサイズ別に分離し、それらを膜に転写し、ターゲットタンパク質に特異的な抗体でプローブすることに依存します。 このガイドは、細胞培養と組織サンプルの両方に適しており、さまざまな検出システムをサポートします。
ウェスタンブロッティングとは？
ウェスタンブロッティングは、分子生物学および生化学における、ターゲットタンパク質の同定および定量のための基礎技術です。 ゲル電気泳動と免疫検出を組み合わせることで、タンパク質発現、翻訳後修飾、分子量を解析できます。
この方法には、サイズによるタンパク質の電気泳動分離、膜への移動、および特定の抗体による検出が含まれます。 このプロトコールは、研究者がバックグラウンドノイズを最小限に抑えて高品質の結果を達成するのに役立つように設計されています。 これには、サンプル調製、ゲル実行、移動、ブロッキング、抗体インキュベーション、および検出のための最適化されたステップが含まれます。
幅広い種類のサンプルに適したこのガイドは、化学発光および蛍光検出システムの両方をサポートし、さまざまな実験ニーズに適応します。
この技術の背景と原則は何ですか？
ウェスタンブロッティング は、複雑な混合物からタンパク質を分離するために使用される ポリアクリルアミド ゲル電気泳動 の一種である SDS-PAGEを介して、サイズによるタンパク質分離の原理に基づいて動作します。 突起では、 ドデシル硫酸ナトリウム はタンパク質を変性させ、均一な負電荷を付与し、負電荷のタンパク質をもたらす。 この変性は、天然タンパク質構造を破壊し、タンパク質が形状や電荷ではなく分子量によってのみ分離されることを保証します。これは正確な分析に不可欠です。
変性したタンパク質はその後ゲルにロードされ、電流が移動を促進するにつれて電気泳動によって分離されます。小さなタンパク質はより速く移動し、サイズベースの分解能を可能にします。 電気泳動後、電界を使用してタンパク質をニトロセルロースまたはPVDF膜に移します。 ブロッキング剤は非特異的結合を防ぎ、一次抗体は特異的タンパク質をターゲットとします。 酵素または蛍光色素に結合した二次抗体により可視化が可能です。 検出は化学発光または蛍光によって達成され、タンパク質の存在と量を示すバンドを生成します。 この方法は特異性と感度が高く、タンパク質分析に最適です。
ステージ1 - サンプル調製
ウェスタンブロッティングを行う前に、抗体が目的タンパク質にアクセスできるようにする必要があります。 この手順では通常、細胞や組織から抽出したタンパク質を含むライセートを調製します。 ライセートは、ローディング・バッファーで複数のアリコートに分け、使用準備が整うまで-80°Cで凍結保存できます。
1
メーカーの指示に従って溶解バッファーを調製します。
- プロテアーゼ阻害剤を含まない場合、プロテアーゼ阻害剤を溶解バッファーに添加します。 リン酸化タンパク質にはホスファターゼ阻害剤を含めます。
プロセス全体を通して、サンプル、バッファー、機器を氷上に置いてください。
プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤カクテル
2
細胞を単離し、溶解バッファー中に懸濁します。
-
細胞1x107個ごとに、溶解バッファー約1 mLを添加して懸濁液を調製します。
-
懸濁細胞の場合：
- 細胞をスピンダウン（100–500 g、5分間、4°C）してPBSで2回洗浄し、ペレットを再懸濁します。
- 再度スピンダウン（100–500 × g、5分間、4°C）し、氷冷した溶解バッファーに再懸濁します。
-
接着細胞は、洗浄、スピンダウン（100–500 g、5分間、4°C）、溶解バッファー中でのペレットの再懸濁の前に、酵素による剥離または機械的な剥離が必要となる場合があります。
細胞を取り扱う際は無菌操作で行ってください。
3
細胞懸濁液を溶解します。
- 溶解バッファー中の細胞を4°Cで10分間、揺り動かしながらインキュベートします。
- 懸濁液を超音波処理して、オープンセルを破壊します。
超音波処理の時間と強度は機器によって異なるため、ある程度の最適化が必要です。
4
懸濁液をスピンダウンし、不溶性内容物をペレット化します。
- 懸濁液を14,000–17,000 x gで5分間、4°Cで遠心分離します。
5
上清を氷上に置いた新しいチューブで保管します。
- ペレットは廃棄できます。
この上清がライセートです。
7
ライセートを複数のチューブに分注します。
- ピペットで等量を各チューブに移します。
ローディング・バッファーを十分量添加するのに十分なスペースを残しておいてください。
8
アリコートをローディング・バッファーで希釈します。
- ローディング・バッファーにDTTが含まれていることを確認してください。
- ローディング・バッファーを添加してアリコートを希釈し、総タンパク質濃度が約1–2 mg/mLとなるようにします。
冷凍庫で保管する前にライセートをローディング・バッファーで希釈すると、ライセートの安定性が向上します。
9
使用準備が整うまで、サンプルを-80°Cで保管します。
ステージ2 - ゲルへのロードと泳動
ゲルをバッファーに浸し、タンパク質サンプルをロードし、ゲルに電流を流すと、タンパク質がゲルの一方の端（陰極）からもう一方の端（陽極）に移動します。 タンパク質はサイズによって分離され、小さいタンパク質ほどゲル中をより速く移動するため、より下方に見られます。
サンプル中の各タンパク質のサイズを確認するため、分子量ラダーとともに泳動させます。
必要な資材
- SDS-PAGEゲル（Tris-Glycine、Bis-TrisまたはTris Acetateベースのゲル）
- 分子量ラダー（例：ab116028）
- ゲル泳動装置
- SDS
- ランニング・バッファー（例：Tris-Glycine、MES、MOPS、Tris-Acetate）
各ステップ
1
タンパク質に適したSDS-PAGEゲルを選択し、泳動装置をセットアップします。
- タンパク質のサイズに基づいてゲルおよびバッファー系を選択または調製します。
- ゲルを泳動装置に入れ、ゲルが完全に浸るようにランニング・バッファーで満たします。
表1：さまざまなタンパク質のサイズに対して推奨されるグラディエントゲル。 当社のラボではグラディエントゲルを使用していますが、アクリルアミド濃度が固定されたゲルもご使用いただけます。
タンパク質のサイズ | 推奨されるゲルおよびバッファー系 |
|---|---|
10–30 kDa |
4–12%アクリルアミド・グラディエントBis-Trisゲル MESランニング・バッファー |
31–150 kDa |
4–12%アクリルアミド・グラディエントBis-Trisゲル MOPSランニング・バッファー |
> 150 kDa |
3–8%アクリルアミド・グラディエントTis Acetateゲル Tris Acetateランニング・バッファー |
表2：固定濃度のTris-Glycineゲルでの使用に推奨されるゲル。 ご自身でゲルを調製される場合、ある程度の最適化が必要です。10 - 15%の分離ゲルからスタートすることをおすすめします。
小さいタンパク質 | 平均的なタンパク質 | 大きいタンパク質 |
|---|---|---|
> 4 kDa | 12–100 kDa | < 200 kDa |
20%分離ゲル | 10–15%分離ゲル | 8%分離ゲル |
Tris-Glycineランニング・バッファー | Tris-Glycineランニング・バッファー | Tris-Glycineランニング・バッファー |
大きいタンパク質ほど、ゲル中のアクリルアミド濃度を低くします。 これにより、密度の低いポリマーが形成され、タンパク質が移動しやすくなります。
泳動装置のセットアップ時には、陽極と陰極が正しい方向に差し込まれていることを確認してください。
2
ライセートを解凍し、完全に変性させます。
- ライセートを解凍した後、氷上で保管します。
- 各ライセートを100°Cで10分間煮沸します。
ライセートは氷上で保管するとpHが変化するため、素早く解凍します。
3
各試料からタンパク質を等量ずつゲルにロードします。
-
推奨量：
- ライセートからのタンパク質10−40 µg
- 精製タンパク質10−500 ng
ウェルにオーバーロードしないよう注意してください。隣接するウェルにサンプルが漏れ出す可能性があります。
ウェルの底にピペットチップが触れないように注意してください。触れるとバンドが変形する可能性があります。
サンプルを添加する前に、ウェルが真っ直ぐであることを確認してください。
ロード後、ステップ4で調製した変性ライセートは、後の使用のために-20°Cで保管することができます。
4
メーカーの指示に従ってゲルを泳動させます。
- 使用する装置と目的タンパク質に応じて、泳動時間および電圧を最適化します。
推奨される通電時間および電圧は、メーカー、ゲルの組成、目的タンパク質によって異なる可能性があります。 より大きいタンパク質は、より高い電圧でより長い時間に泳動させます。
5
転写の準備が整ったら、泳動装置からゲルを取り出します。
- ゲルナイフを使用して慎重に装置を開け、ゲルを取り出します。
ステージ3 - ゲルからメンブレンへの転写
電気泳動後、抗体とインキュベーションするためにタンパク質をメンブレンに転写します（「ブロッティング」とも言います）。 メンブレンにはニトロセルロースまたはPVDF製のいずれも使用できます。
電気泳動と同様に、メンブレンへの転写は電荷を加えることで達成され、これによってタンパク質がメンブレンに移動します。 タンパク質は、陰極近くのゲルから陽極に向かって移動し、そこでメンブレンに結合します。
1
PVDF膜を使用する場合、メタノールにメンブレンを浸します。
この手順はPVDF膜で必須ですが、ニトロセルロース膜では不要です。 PVDFは本来疎水性であるため、バッファーを効果的に通過させるためにはメタノールで活性化する必要があります。
2
メンブレンを水に浸した後、転写バッファーに4°Cで10分間浸します。
3
SDS-PAGEゲルとメンブレンを転写カセットに組み立てます。
- ゲルは陰極に最も近い位置に配置してください。
- メンブレンは陽極に最も近い位置に配置してください。
- 小さいローラーでスタックを押し下げ、気泡を取り除きます。
ろ紙がメンブレンと同じサイズに裁断されていることを確認してください。
転写装置の組立てに関する詳細なガイダンスについては、メーカーの指示を参照ください。
4
メーカーの指示に従って転写を行います。
推奨される通電時間および電圧は、メーカーによって異なる可能性があります。 最適化が必要な場合があります。
5
転写装置からゲルとメンブレンを取り出します。
ステージ4 - 転写状況の確認（任意）
先に進む前に、タンパク質がメンブレンに正常に転写されたことを確認することができます。
ゲルをCoomassie染色で染色し、転写が正常に行われたことを確認することができます。
PAGEゲルとメンブレン上のタンパク質の量を比較するための最初の確認として、あらかじめ染色した分子量ラダーを使用することができます。
蛍光ウェスタンブロッティングにはPonceau S染色は推奨されません。十分に洗浄してもバックグラウンド蛍光が高くなる可能性があるためです。 これに代わるものとして、蛍光を発しないタンパク質染色もあります。
必要な資材
- メンブレン
- SDS-PAGEゲル
- Coomassie染色（例：ab119211）
各ステップ
1
あらかじめ染色した分子量ラダーの色付きのバンドを観察します。
- 色付きのバンドがメンブレン上に明瞭に見えます。
2
SDS-PAGEゲルをCoomassie染色で染色します。
- ゲルをCoomassie染色液に浸し、メーカーの指示に従ってインキュベートします。
- バックグラウンドが除去されるまで水で十分に洗浄します。
- 青色のバンドは、ゲル上に残存するタンパク質を示します。
転写が正常に行われた場合でも、転写後のSDS-PAGEゲルにはなおタンパク質が残っています。 ゲルがほぼ透明になるようにしてください。
ステージ5 - ブロッキングおよび抗体インキュベーション
抗体のインキュベーションには、以下の手順を使用します。 化学発光ウェスタンブロッティングにローディング・コントロール抗体を使用する場合、ストリッピング後に同じメンブレン上で以下の染色手順を繰り返すことができます。
蛍光ウェスタンブロッティングでは、以下の手順に従って、メンブレンを複数の抗体セットと同時にインキュベートすることができます。 ローディング・コントロール抗体と検出抗体は、ストリッピングの必要なく、同じメンブレン上で行うことができます。
必要な資材
-
ブロッキング・バッファー［例：3–5%ミルクまたはBSA（TBST中）、もしくは非哺乳類のタンパク質バッファー］
-
洗浄バッファー（例：TBST）
-
メンブレン
- 標識済み一次抗体
各ステップ
約12時間15分
1
メンブレンを容器に入れ、ブロッキング・バッファーで覆います。
- 蛍光ウェスタンブロッティングの場合、メンブレンを室温で1時間、静かに揺り動かしながらインキュベートします。
- 化学発光ウェスタンブロッティングの場合、メンブレンを4°Cで一晩または室温で1時間、静かに揺り動かしながらインキュベートします。
ブロッキング・バッファーにはミルクまたはBSA（TBST中3–5%）が含まれています。
一般的に、BSAの方が抗体と交差反応するタンパク質が少ないため、より明確な結果が得られます。 ミルクの方がブロッキング・タンパク質の種類が豊富なため、一部の抗体ではミルクを用いた方が良好に機能します。
既知の場合、ブロッキング・バッファーが抗体データシートに記載されています。
2
抗体をブロッキング・バッファーで推奨希釈濃度まで希釈します。
最適な希釈濃度は、抗体のデータシートに記載されていることが多いです。
記載されていない場合、段階希釈を行って、最適な抗体濃度を決定する必要がある場合があります。
3
一次抗体（ブロッキング・バッファー中）でメンブレンを覆います。
- 4°Cで一晩または室温で1時間、静かに揺り動かしながらインキュベートします。
インキュベーション時間の最適化が必要な場合があります。
4
メンブレンを洗浄バッファーで5分間×3回洗浄します。
ステージ6 - 検出
インキュベーションが完了すると、ウェスタンブロッティングの画像を取得する準備ができました。
化学発光検出では、まず化学発光基質溶液中でブロットをインキュベートします。これによりHRP標識済み抗体が存在する場所で発光が見られます。 ブロット上のこれらの光のバンドは抗体結合に対応し、ブロット上のバンドとして分離されます。 化学発光ブロットは従来、X線フィルムベースの技術を用いて画像化されてきましたが、ほとんどが高品質の画像が得られるベンチトップ型電荷結合素子（CCD）イメージング装置に置き換えられつつあります。
必要な資材
- 標識済み抗体（例：Alexa-Fluor® 抗体）で染色したブロット
- 70%エタノール
- リントフリークロス（綿）
- シリコンマット
- ろ紙（ドライスキャンする場合）
- TBST（ウェットスキャンする場合）
- イメージングシステム
AlexaFluor® はLife Technologiesの登録商標です。 AlexaFluor® 色素標識は、Life Technologiesによりアブカムにライセンスが付与されている技術を含んでいます。
各ステップ
1
リントフリークロス（綿）を使用し、70%エタノールで撮影用スキャンベッドを拭きます。
バックグラウンド蛍光を避けるため、スキャンベッドはできる限り清潔に保ってください。
2
イメージングシステムでメンブレンをスキャンします。
-
メンブレンをウェットスキャンする場合：
- タンパク質側を下向きにしてメンブレンをスキャンベッドに置きます。
- スキャン領域全体にTBSTを約5 mL噴霧します。
- メンブレンの上にシリコンマットを置き、ローラーを使用して気泡を取り除きます。
- 蓋を閉め、機器の取扱い手順に従ってスキャンします。
-
メンブレンをドライスキャンする場合
- 2枚のろ紙でメンブレンを挟んでホイルで覆い、一晩放置して乾燥させます。
- タンパク質側を下向きにしてメンブレンをスキャンベッドに置きます。
- メンブレンの上にシリコンマットを置き、所定の位置に保持します。
- 蓋を閉め、機器の取扱い手順に従ってスキャンします。
ウェットスキャンは、ヒストンの場合に最適です。
3
スキャンベッドからメンブレンを取り除き、リントフリークロス（綿）を使用し、70%エタノールで撮影用スキャンベッドを拭きます。
バックグラウンド蛍光を避けるため、スキャンベッドはできる限り清潔に保ってください。
ステージ7 - メンブレンのストリッピング（任意）
メンブレンをストリッピングすることで、メンブレンから抗体を除去し、別の抗体セットで再染色することができます。 これは、メンブレンをローディング・コントロール抗体とインキュベートする場合に役立ちます。
必要な資材
- ストリッピングバッファー（例：ab282569）
- TBST
- PBS
- メンブレン
- ECL検出試薬
各ステップ
約30分
1
メンブレンをストリッピング・バッファーでストリッピングします。
- ストリッピング・バッファーで約20分間インキュベートします。
メンブレンを完全に覆う量のバッファーを使用します。
2
PBSで5分間、室温でメンブレンを洗浄します。
3
ECL検出試薬を少量用いてメンブレンをインキュベートします。
- 約5分間インキュベートし、ストリッピングが正常に行われたことを確認します。
- メンブレンが透明であれば、ブロッキングと抗体のインキュベーションを行います。
ステージ8 - データ解析
タンパク質は、分子量ラダーで確認されるように、予想される分子量またはその近傍にあるバンドによって特定することができます。 非特異的な相互作用を除外するには、ネガティブ・コントロールレーンに同じバンドが存在しないことが必要です。 例えば、上図では、ネガティブ・コントロールレーンにターゲット（CD133）のバンドがないことが確認できます。
以下のようなさまざまな理由により、バンドは予想される分子量とは異なる場合があります。
- リン酸化やグリコシル化などの翻訳後修飾により、タンパク質のサイズが増大します。
- スプライシングバリアントやアイソフォームにより、同じ遺伝子から異なるサイズのタンパク質が産生される場合があります。
- 相対的電荷：アミノ酸の組成がタンパク質がゲルを通過する距離に影響を及ぼす可能性があります。
- 多量体：強力な相互作用により高い位置にバンドが出現する可能性がありますが、還元条件下では通常これは防ぐことができます。
バンドの分子量が想定外の場合やその他の方法では解決が難しい場合は、トラブルシューティングガイドを参照ください。
ウェスタンブロッティングのワークフローを前進させましょう
ウェスタンブロッティング染色に不可欠な日常的な試薬を新しい低価格で提供し、専門的に厳選されたリソースと合わせて、ワークフローを前進させるために必要なすべてを揃えることができます。 当社の抗体はすべて、広範な検証と厳格なQC法を経ており、信頼性の高い ウェスタンブロット試薬 とプレミアム品質に自信を持っていただけます。
他の方法と比べてどうでしょうか。
酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）や質量分析法などの技術と比較して、ウェスタンブロッティング分析では特異性、感度、可視化確認のバランスが取れています。 ELSIAは、生体サンプル中のタンパク質、抗体、または抗原を検出するための高度に特異的で定量的なデータを提供しますが、サイズ分解能がありません。
質量分析は、詳細なタンパク質同定を提供しますが、複雑な計装と専門知識が必要です。 免疫組織染色は組織内での局在化を可能にしますが、定量性は低いです。 ウェスタンブロッティング解析は、サイズベースの分離と抗体特異性を組み合わせることで際立っており、翻訳後修飾およびアイソフォームの検出を可能にします。 タンパク質サイズが重要な場合、質量分析よりもアクセスしやすく、ELISAよりも有益です。 ハイスループットではありませんが、ウェスタンブロッティング解析は、タンパク質発現を検証し、分子量を評価するためのゴールドスタンダードです。
主な用途は何ですか？
ウェスタンブロッティングは、生物医学研究、診断、バイオテクノロジー全般で使用されています。 細胞ライセートまたは組織抽出物中の特定のターゲットタンパク質の検出を可能にし、遺伝子発現、シグナル伝達パスウェイ、および疾患バイオマーカーの研究に不可欠です。 研究者は、抗体の特異性を確認し、ノックダウンや過剰発現の実験を検証し、リン酸化などのタンパク質修飾を監視します。
ウェスタンブロッティングでの免疫検出により、複雑なサンプル内のターゲット抗原の同定が可能になります。 定性分析と半定量的解析の両方をサポートします。 臨床現場では、ウェスタンブロッティングが感染症および自己免疫疾患の診断に役立ちます。 さまざまなサンプルタイプと検出システムへの適応性により、プロテオミクス、細胞生物学、分子診断の多目的ツールとなります。 このプロトコールは、タンパク質相互作用および結合特性の研究を含む、基礎研究から翻訳研究までのアプリケーションをサポートします。
どのような制限がありますか？
その強みにもかかわらず、ウェスタンブロッティングには限界があります。 時間がかかり、サンプル調製から検出まで、各ステップを慎重に最適化する必要があります。 感度は、抗体の品質、転写効率、ブロッキング条件の影響を受ける可能性があります。 定量は半定量的であり、結果は実験によって異なる場合があります。 低存在量のタンパク質の検出には、シグナル増幅または濃縮戦略が必要な場合があります。 膜の取り扱いとイメージングは、ばらつきをもたらす可能性があります。
さらに、この技術は、SDS-PAGEで分離できる変性タンパク質に限定されています。 免疫組織染色や質量分析のような包括的なプロファイリングのような空間情報は提供されません。 適切なコントロールと検証は、信頼性の高い解釈に不可欠です。
トラブルシューティング
ウェスタンブロッティングでよく見られる問題には、弱いシグナル、高いバックグラウンド、歪んだバンドなどがあります。 弱いシグナルは、低タンパク質濃度、抗体結合不良、または非効率な転写から生じる可能性があります。 適切な溶解、正確な定量、最適化された抗体希釈を確実にします。 高いバックグラウンドは、多くの場合、不十分なブロッキングまたは過剰な抗体濃度に起因します。
適切なブロッキングバッファーを使用し、十分に洗浄します。 バンドの歪みやスメアは、ウェルの過負荷、ゲル重合の不均一、または誤った運転条件によって引き起こされる可能性があります。 ゲルの組成と充填量を確認します。 転写が不完全な場合は、膜の活性化と転写設定を確認してください。 一貫したサンプル処理、清潔な装置、および検証済みの試薬は、トラブルシューティングと結果の改善の鍵となります。
ウェスタンブロッティングを使用した低存在量タンパク質の検出に関する当社のプロトコールをご覧ください
参考文献
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- Mishra, M., Tiwari, S. & Gomes, A. V. タンパク質の 精製 と分析：次世代 ウェスタンブロッティング 技術。 専門家によるプロテオミクス改訂 14、 1037–1053 （2017）。
- Sule, R., Rivera, G. & Gomes, A. V. ウェスタンブロッティング (immunoblotting): 歴史、理論、用途、 プロトコール 、問題。 バイオテクニック 75、 99–114 (2023)。
- Gilda, J. E. & Gomes, A. V. ウェスタンブロット 精確さ における信頼性を向上させる必要性と戦略。 専門家によるプロテオミクス改訂 11、 549–560 （2014）。
- Mahmood, T. & Yang, P. C. ウェスタンブロッティング: 技術、理論、トラブルシューティング N. Am. J. Med. Sci. 4, 429–434 (2012).