スフェロイド調製および免疫蛍光染色プロトコール
スフェロイドの調製からイメージングまでの包括的なプロトコール
その他のプロトコール
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このプロトコールは、免疫蛍光染色を使用して3Dスフェロイドを調製および染色するためのガイドを提供します。 このプロトコールは、疾患モデルと腫瘍スフェロイドにも適用でき、研究者は3D培養システムで健康と病理学的状態の両方を研究することができます。 スフェロイドは2D培養よりもin vivo組織構造をより正確に模倣するように設計されており、薬物スクリーニング、がん研究、および組織工学において生物学的関連性が強化されています。 プロトコールは、スフェロイドの形成、固定、透過処理、ブロッキング、抗体染色、およびイメージングを対象としています。 これには、再現性と高品質の結果を確保するための材料、インキュベーション条件、トラブルシューティングのヒントに関する推奨事項が含まれています。 適切なサンプル調製は、さまざまな顕微鏡法で高品質のイメージングと再現性のある結果を達成するための重要なステップとして強調されています。 マトリゲルまたは合成足場のいずれを使用するかにかかわらず、このガイドは研究者がさまざまな生物学的アッセイのためにスフェロイドの取り扱いと可視化を最適化するのに役立ちます。
各スフェロイド/オルガノイドが異なるため、特定のモデルに合わせてプロトコールを最適化する必要がありますが、このプロトコールは開始リファレンスとして使用できます。
はじめに
スフェロイドモデルは、複雑な細胞間および細胞マトリックス間の相互作用を複製する能力があるため、生物医学研究でますます使用されている。 このプロトコールにより、研究者は、タンパク質の発現と局在を可視化する強力な技術である免疫蛍光染色を使用してスフェロイドを生成および解析することができます。 プロトコールは機能的イメージングアプローチもサポートし、動的細胞プロセスを静的な機能的マーカーとリンクさせることで、より深い生物学的洞察を可能にします。 段階的なアプローチにより、さまざまな細胞タイプや実験目標への適合性が保証されます。 蛍光顕微鏡は、スフェロイドのタンパク質発現と局在を可視化するために不可欠であり、高い特異性と空間分解能を提供します。 足場ベースまたは足場フリーの方法を統合することで、このプロトコールは柔軟な実験設計と高解像度イメージングをサポートします。 In vitro試験の生理学的関連性を強化したい科学者にとって理想的です。
背景と原則
スフェロイドは細胞の3D凝集体であり、従来の2D培養と比較して組織の微小環境をよりよくシミュレートします。 それらの形成は、非接着条件下での細胞自己組織化、または吊り下げ滴やマイクロ流体などの特殊なプラットフォームに依存します。 スフェロイドの免疫蛍光染色には、形態を保持するための固定、抗体へのアクセスを可能にする透過処理、および非特異的結合を減少させるためのブロッキングが含まれます。 このプロトコールは、構造の完全性を維持し、正確な染色を確実にするために、各ステップ、特に固定と抗原賦活化を最適化することの重要性を強調しています。
最適な蛍光シグナルを達成し、イメージング中のスペクトルのオーバーラップを最小限に抑えるには、適切な励起波長を選択することが不可欠です。 高度な画像処理技術は、画像品質を向上させ、スフェロイド画像から定量的データを抽出するために不可欠です。
スフェロイドは、さまざまな方法（非接着プレート、ハンギングドロップ、マイクロ流体力学、スピナー、アガロース型、バイオプリンティングなど）を使用して、腫瘍、胚細胞、神経組織、肝細胞、乳腺細胞などの幅広い細胞から調製することができます。 薬物スクリーニング、がん研究、毒物学、組織バイオエンジニアリングでますます使用されています。
ステージ1 - 3D環境でのスフェロイドの調製
スフェロイドは、幅広い方法を使用して作成された3D in vitro凝集体です。 3D培養法の種類は、組織または細胞の起源、費用、および研究の目的によって異なります。 その形成方法とは無関係に、スフェロイドを異なる細胞外足場に含ませ、天然組織構造をよりよく模倣する環境を提供することができます。 スフェロイドは足場なしで分析することもできます。
必要な資材
- 非接着組織培養プレート（96ウェルプレートまたはその他）
- 滅菌PBS 1%ウシ血清アルブミン（BSA）
- イメージンググレードプレート（96ウェルプレートまたはその他）
- 3D足場
各ステップ
1
スフェロイドを作製するために、幅広い方法を用いることができる。 丸底非付着組織培養プレート法は、ウェルに細胞を播種します。
2
細胞培養インキュベーター内で37ºCでインキュベートし、良好なスフェロイド形成を目視で確認します。
ウェルあたりの細胞数とインキュベーション時間は、使用する細胞の種類によって異なります（例：2000HCT116細胞 - 96時間）。 最適な条件を決定するために、まず細胞数とインキュベーション時間の異なる組み合わせを使用することをお勧めします。
3
広口氷冷チップ（または清潔なはさみでチップを切断）を使用してスフェロイドを回収し、氷冷チューブに入れます。
- チューブへの細胞接着性を低下させるため、チューブは滅菌1%ウシ血清アルブミン（BSA）/リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で一晩前コーティングする必要があります。
4
チューブを4ºC（20 x g）で20秒間回転させます。
5
培地は吸引して慎重に廃棄してください。
6
各チューブに、マトリゲル™ または別の3D足場材料 (合成足場、コラーゲン、ハイドロゲルなど) を追加します。
使用する足場は、アッセイに必要な剛性によって異なります。
7
ワイドボアチップを使用して、静かに上下に2回ピペッティングして、非常に慎重に混合します。
8
足場とスフェロイドミックスをPDLコーティングイメージンググレードプレートのウェルに分注します（例：96ウェルフォーマット）。
9
細胞培養インキュベーター内で37ºCで15分間インキュベートします。
10
温めた培地（37ºC）を加えます。
11
細胞培養インキュベーター内で37ºCで90分間インキュベートします。
インキュベーション時間は、生物学的アッセイの目的によって異なり、経験的に定義する必要があります（例：浸潤アッセイ、増殖アッセイなど）。
ステージ2 - スフェロイドの固定
2D免疫細胞染色と同様に、固定は3D免疫蛍光染色において不可欠なステップです。 正確な固定法によって、スフェロイドの細胞形態および構造が保存および安定化され、最良の結果が得られます。 スフェロイドの固定によって、サンプルを分解する可能性のあるタンパク質分解酵素が不活性化され、微生物による分解からサンプルが保護されます。
必要な資材
- PBS（ab285410）
- 4%パラホルムアルデヒドおよび/または100%メタノール（-20°Cで冷却）
各ステップ
1
培地を取り出し、PBSで3回洗浄します。
2
PBSを除去し、細胞固定液（できればドラフトチャンバーの下）を加えます。 特に、以下の2つの方法を用いることができます：
- 室温で10分間、PBS pH 7.4中の4%パラホルムアルデヒド
- 100%メタノール（-20°Cで冷却）、4°Cで5分間
3
固定液を取り外し、プレートをPBSで3回洗浄します。
ホルムアルデヒド固定剤は、共有結合タンパク質架橋結合を引き起こします。 この効果は、異なるエピトープをマスクし、抗体結合の可用性を低下させることができます。 この効果を最小化するために、固定後に追加の熱誘導抗原賦活化ステップを含めることができ、最適化することができます。 このため、スフェロイドはオルガノイド採取液を用いて回収し、抗原賦活化バッファー（例：Tris/EDTA pH 9.0、クエン酸ナトリウム pH 6.0など）を加え、チューブを96 - 98°Cの加熱ブロック内で20分間インキュベートします。 次に、透過処理とブロッキングのステップに進みます。
ステージ3 - 透過処理
スフェロイドを界面活性剤とインキュベートすると、細胞内標的の免疫染色に必要である抗体の細胞膜への浸透が起こります。 界面活性剤によって透過処理が異なるため、特定のターゲット・タンパク質に対して他のものよりも有効であるものもあります。 例えば、ミトコンドリアや核に局在するタンパク質は、多くの場合、検出にTriton X-100などの界面活性剤を必要とします。
細胞外マトリックスの3D生体サンプルには、界面活性剤Triton X-100が推奨されます。 使用する界面活性剤、最適な割合、インキュベーション時間は、ターゲット・タンパク質によって異なるため、最適化する必要があります。 メタノール固定もまた細胞を透過化し、この固定方法を使用してより高い抗体浸透を達成することができます。
必要な資材
- 透過処理バッファー：PBS 0.5% Triton X-100、PBS 2% Triton X-100、またはPBS 10% Triton X-100
各ステップ
1
PBSを除去し、平坦な振とう機を用いて室温で1時間透過処理バッファーを加えます。
ステージ4 - ブロッキング、免疫染色、およびイメージング
非特異的抗体結合を低減するには、ブロッキングステップが必要です。 血清および／または豊富なタンパク質バッファーを使用して、潜在的な非特異的結合部位を飽和させます。 理想的には、ブロッキングバッファーに含まれる血清型は、最良の結果を得るために二次抗体の種と一致させる必要があります。 スフェロイド免疫染色については、室温で水平振とう器などを用いて、すべてのブロッキング、洗浄、免疫染色のステップを穏やかに混合しながら実施してください。
必要な資材
- 0.1% Tween、1%ウシ血清アルブミン、22.52 mg/mLグリシン、10%ヤギ血清ab7481を含むPBS
- PBS
- 洗浄バッファー：0.1% Tween含有PBS
- 一次抗体
- 二次抗体
- 0.1%アジ化ナトリウム含有PBS
各ステップ
1
透過処理バッファーを除去し、0.1% Tween、1%ウシ血清アルブミン、22.52 mg/mLグリシン、10%ヤギ血清を含むPBSを加えます。
- ゲルを振とう機の上で、室温で時間～一晩インキュベートします。
2
0.1% Tween (洗浄バッファー) を含む PBS でサンプルを洗浄します。
3
一次抗体（非結合型または結合型）を目的濃度で添加します。
- 十分な免疫染色を達成するために、一次抗体/標識抗体の滴定が必要になる場合があります。 メーカーのプロトコールに従ってインキュベートします。
標識一次抗体を使用する場合、二次抗体のインキュベーションは省略できます（下記参照）。
4
洗浄バッファーで4回洗浄します（4回の洗浄はそれぞれ1時間）。
5
必要に応じて、二次抗体および/または核染色（例：DAPIまたはヘキスト）を追加します。 メーカーのプロトコールに従って一晩インキュベートしてください。
6
洗浄バッファーで4回洗浄します（4回の洗浄はそれぞれ1時間）。
7
PBSを加え、封入剤または保存バッファー（0.1%アジ化ナトリウム含有PBS）を加えます。
最良の結果を得るには、封入剤または保管バッファーの種類を最適化する必要があります。これは、解析用に選択したイメージングシステムおよび対物レンズによって異なります。
8
撮像に必要なまで、暗所で4ºCで保管します。
9
適切な励起・蛍光フィルターセットやレーザーを使用してサンプルをイメージングします。
他の方法との比較
2D免疫細胞染色と比較して、3Dスフェロイド免疫蛍光染色は、組織構造および細胞挙動の優れたモデリングを提供します。 2D培養は扱いやすいですが、スフェロイドの空間的複雑さを欠いています。 オルガノイドはさらに複雑ですが、標準化は困難です。 スフェロイドは、生理学的関連性と実験的コントロールのバランスをとります。 このプロトコールはまた、足場ベースおよび足場フリーのアプローチを対比し、研究者がアッセイ要件に基づいて選択できるようにします。 このプロトコールは、特定の細胞集団をスフェロイド内の他の細胞と比較することを可能にし、細胞の特徴および相互作用の詳細な解析を容易にします。 抗原賦活化と最適化された透過処理を含めることで、この方法はよりシンプルな染色プロトコールと区別され、シグナルの明瞭さと再現性が向上します。 分子遺伝学的アプローチは、スフェロイドモデルにおける遺伝子機能のより深い解析のために統合することもできます。
薬物スクリーニングへの応用
このプロトコールは、オンコロジー、毒性学、再生医療、医薬品開発など、幅広い研究分野に適用されます。 このプロトコールは、スフェロイド内の細胞周期動態および細胞分裂の研究を可能にします。 腫瘍細胞、肝細胞、神経組織、または乳腺に由来するスフェロイドを使用して、浸潤、増殖、および治療に対する反応を研究することができます。 このアプローチを使用して、細胞周期停止および再生プロセスも調査することができます。 免疫蛍光染色はバイオマーカーの正確な局在化を可能にし、治療ターゲットまたは細胞応答の評価に理想的です。 このプロトコールは、ハイコンテントイメージングと定量分析をサポートし、トランスレーショナルリサーチと個別化医療アプローチを促進します。 また、3Dコンテキストでの抗体特異性の検証にも適しています。
3D細胞培養の限界
その利点にもかかわらず、スフェロイド免疫蛍光染色は課題を提示します。 抗体の浸透は、特に大きなスフェロイドまたは高密度足場では、一貫性がありません。 固定によりエピトープがマスクされ、抗原賦活化を慎重に最適化する必要があります。 イメージング深度は光散乱と自家蛍光によって制限され、信号品質に影響を与える可能性があります。 さらに、スフェロイド形成は細胞型に依存し、播種密度およびインキュベーション時間の経験的調整を必要とする場合があります。 プロトコールでは、スフェロイドの破壊を避けるために細心の注意を払った取り扱いが要求され、結果は使用される足場の組成および撮像システムによって異なる場合があります。
トラブルシューティング
よくみられる問題には、スフェロイド形成不良、染色の弱さ、および背景の高値などがあります。 スフェロイドの完全性を向上させるには、細胞密度とインキュベーション時間を最適化します。 染色が弱い場合は、抗体濃度または透過処理条件を調整します。 ブロッキングバッファーと洗浄ステップを精緻化することで、バックグラウンドノイズを低減できます。 固定液が新鮮で、適切な条件下で使用されていることを確認します。 一貫性のないイメージングの場合は、マウンティングメディアの互換性を確認し、適切なフィルターセットを使用してください。 エピトープマスキングが発生した場合は、抗原賦活化の手順を取り入れてください。 3Dコンテキストで抗体を検証し、パイロット実験を実行して条件を改良します。