このプロトコールでは、培養細胞および組織サンプルからのRNA単離と逆転写のための信頼できる方法の概要を説明します。これには、細胞および組織からのTRIzol^®ベースのRNA抽出、ゲノムDNAを除去するためのDNase処理、および逆転写酵素を使用したcDNA合成の詳細な手順が含まれます。分子生物学および遺伝子発現解析の研究者向けに設計されたこのプロトコールは、RT-PCRやqPCRなどのダウンストリームアプリケーションに適した高品質のRNAを保証します。このガイドは、明確な説明とトラブルシューティングのヒントにより、RNAワークフローの再現性と効率性をサポートします。接着細胞や複雑な組織を扱う場合でも、このプロトコールは正確な遺伝子発現研究のための強固な基盤を提供し、市販のRNA単離キットも代替ワークフローを求める研究者に利用可能です。

はじめに

RNA単離と逆転写は分子生物学の基礎技術であり、研究者は遺伝子発現とトランスクリプトームプロファイルを研究することができます。 mRNA、rRNA、tRNAなどのさまざまなRNA種を含むRNA分子は、遺伝子発現およびタンパク質合成において重要な役割を果たし、細胞機能を理解するためにそれらの単離および解析が不可欠です。このプロトコールは、高品質のRNAを抽出し、それを相補的DNA（cDNA）に変換するための包括的なワークフローを提供します。この方法は、細胞培養と組織サンプルの両方に最適化されており、実験モデル全体で汎用性を確保します。単離後、RNAはcDNA合成のテンプレートとして機能し、RT-PCRや遺伝子発現解析などの下流アプリケーションをサポートします。このプロトコールに従うことで、科学者はRNAの分解を最小限に抑え、DNAコンタミネーションを排除し、下流アプリケーションのための信頼性の高いcDNAを生成することができます。このガイドは、RNAの取り扱いと逆転写に対する標準化されたアプローチを求める初心者と経験豊富な研究者の両方に最適です。

背景と原則

RNA単離には、細胞を破壊しRNAの完全性を維持するTRIzol^®などの試薬を使用して、RNAを他の細胞成分から分離することが含まれます。細胞溶解は、細胞からRNAを抽出する最初のステップであり、さらなる処理のための核酸の放出を確実にします。クロロホルムとの相分離により、RNAの選択的な抽出が可能となります。遠心分離後、その後の工程でRNAを得るために上水相を慎重に除去します。次にイソプロパノール沈殿を行い、遠心分離後に目に見えるRNA沈殿物またはペレットを形成します。エタノール洗浄によりRNAをさらに精製します。フェノール抽出は、コンタミネーション物質を除去するためにRNA精製の一部としてしばしば使用され、下流アプリケーションに適した高品質で精製されたRNAを確実にするためにRNAを完全に精製することが不可欠です。さまざまなRNA抽出手順およびRNA単離方法が存在し、これは、効率的にRNAを抽出および単離するために、TRIzol^®に保存された微生物サンプルおよびサンプルを含む、異なるサンプルタイプに合わせて調整されます。 RNA分解を防ぎ、サンプル品質を維持するためには、保管中の凍結解凍サイクルを最小限に抑えることが重要です。 DNase処理は、残留ゲノムDNAを除去し、RNAサンプルを処理してコンタミネーション物質を除去するために重要です。 RNAの安定性はRNA分解酵素による危険性があるため、RNase阻害剤が抽出および精製中のRNAを保護するために含まれています。 RNAの完全性を評価することは、逆転写前の重要な品質管理ステップです。

逆転写はその後、逆転写酵素を使用し、鋳型RNAからcDNAを合成しますが、逆転写酵素活性とRNase H活性が低いMoloneyマウス白血病ウイルスに由来するものなどの逆転写酵素の選択により、cDNAの収量、長さ、および短いcDNA断片の生成に影響を及ぼします。ランダムヘキサマープライマーは、鋳型RNAからのcDNA合成に一般的に使用され、cDNAライブラリ構築およびウイルスゲノムの解析などの下流アプリケーションのための相補的なcDNA鎖の生成を可能にします。ゲル電気泳動は、合成cDNAの品質とサイズを確認するために使用できます。このcDNAは、元のRNAの安定かつ増幅可能な表現として機能し、PCRベースの方法による遺伝子発現解析を可能にします。プロトコールは、最適な結果を得るためにRNAの純度と完全性を強調しています。

試薬

氷冷したPBS
TRIzol^®
クロロホルム
イソプロパノール
75%エタノール
DEPC処理H₂O／水
DEPC処理TEバッファー
DNaseカクテル：Rq1 RNaseフリーDNase、DNase 10X反応バッファー、DEPC処理H₂O、RNase Out
RTサンプル：DEPC処理水、5Xファーストスタンドバッファー、DTT 0.1 M、0.1 ug/ uLまたは3 ug/ uLの1/30希釈のプライマー、BSA

タブ名

細胞の手順

タイムライン番号

ステージ1 - 細胞および組織のRNA単離手順

1x10⁶個以上の細胞を使用し、培地を吸引し、氷冷したPBS（1–2 mL）で1回洗浄します。

PBSを吸引し（可能な限り取り除く）、TRIzol^® 1 mLを添加します。

プレートを軽く擦過した後、ピペットでTRIzol^®を取り除き、TRIzol^®／細胞ライセートを1.5 mLエッペンドルフチューブに入れます。

室温で5分間放置します。

クロロホルム250 µLを添加し、チューブを約15秒間激しく振とうします。

室温で5分間放置します。

12,000 x gで15分間、遠心分離します。

ピペットを使用して水相を慎重に取り除きます。

この時点で、各チューブには3つの層があります：
上層：。透明、。水
中層/間期：。白色沈殿したDNA
下層：。ピンク有機相

ピペットを使用して水相を慎重に取り除きます。
水相の一部を残します（DNA層の約1 mm上。DNAによるコンタミネーションを防ぐため）。
別の1.5 mLエッペンドルフチューブに入れます。

ここでは大きなピペットを使用しないでください。液体を吸引する速度と力をコントロールするのが難しくなり、有機相やDNA相の一部を吸引する可能性が高くなります。

イソプロパノール550 µLを水相に添加し、静かに混和します。

室温で5分間放置します。

最大速度（約12,000 x g）で10分間遠心分離します。

収量が低いと予想される場合、30分間遠心分離します。

サンプルを氷上に置きます。

次に、イソプロパノールを捨て、75%エタノール（DEPC処理H₂O中）1 mLを添加します。
静かに混和します。
11,500 x gで5分間遠心分離します。

各チューブの底にペレットがかろうじて見えるようになります。

エタノールを捨て、ペレットを空気乾燥させます。

ペレットが乾燥しすぎると、RNAが結晶化し、再溶解が非常に困難になるため、これは重要なステップです。エタノールの蒸発が十分でない場合も、RNAが溶液に入るのを妨げます。

チューブを遠心分離して、蒸発を早めます。

エタノール洗浄液の大部分を捨てた後、エッペンドルフチューブの底に約30–40 µLが残ります。
蒸発を早めるため、チューブを短時間遠心してチューブの側面に残った液体を底に押し付け、可能な限りピペットでエタノールを取り除きます。

ペレット自体の周囲に溶液の小さなメニスカスのみが残っているときが、DEPC処理水をRNAペレットに添加する最適なタイミングです。

RNAペレットに水を添加します。

RNAペレットに約15–25 µL（収量による）のDEPC処理TEバッファーまたはDEPC処理水を添加します。
小さなエッペンドルフチューブにRNAを1/40で希釈（TEバッファー48.8 µLに1.2 µLを希釈）し、マイクロキュベット（パス長 = 1 cm）に添加します。
次に、260 nmで吸光度を測定します。

260/280の比率は1.8より大きくなるはずです。 1.5–1.6以下の場合、RNAは少なくとも部分的に分解されている可能性が高いです。比率が低い場合、DNAやチオシアネートによるコンタミネーションを示唆しています。濃度は、基本的に260 nmでのODと同等です（µg/µL）。

細胞における手順との違いは、ステップ1-3のみです。

滅菌培養チューブ（12x75 mmが好ましい）にTRIzol 1 mLを加え、その後凍結組織を加えます。

添加する凍結組織は約20 mgを超えないようにしてください。

氷上で、ホモジナイザーを用いて25/30の設定で10秒間×計2回、組織を粉砕します。

TRIzol溶液を1.5 mLエッペンドルフチューブに入れます。

上のボタンを使用して「細胞の手順」に切り替え、ステップ4から続けます。

ステージ2 - RNAサンプルのDNase処理

必要な資材

DNaseカクテルは以下から構成されます（1サンプルあたり）。

RQ1 RNaseフリーDNase：1 µL
DNase 10反応バッファー：2 µL
DEPC処理H₂O：6 µL
RNase Out：0.5 µL

各ステップ

処理するRNAサンプルの数に基づき、上記のマスターミックスを調製します。

以下の方法でRNAを調製します。

小さなエッペンドルフチューブにRNA 2 µg［2 µg／濃度（µg/µL）で算出］を添加します。
さらにDEPC処理水を添加して、RNAの総容量を11 µLにします。

例えば、RNA濃度が1 µg/µLの場合、RNA 2 µLをDEPC水9 µLに添加します。

DNaseマスターミックス9 µLをRNAに添加し、総容量を20 µLにします。

サーマルサイクラーを用いて、サンプルを37°Cで15分間インキュベートした後、65°Cで20分間インキュベートし、氷上に置きます。

各サンプルを短時間遠心分離し、全容量がチューブの底にあることを確認します。

DNase処理したRNAは、直ちに逆転写反応に使用することができます。

ステージ3 - DNase処理RNAの逆転写

ほとんどの状況下において、RNAの各サンプル（1 µg、またはDNase処理反応から10 µL）に逆転写酵素を添加し、また2本目の1 µgアリコートを非逆転写コントロールとして使用します。

必要な資材

DEPC処理水13 µL
5Xファーストストランド・バッファー16 µL
DTT 7 µL（0.1 M）
ランダムプライマー8 µL（濃度 = 0.1 µg/µLまたは3 µg/µLの1/30希釈）
BSA 8 µL
dNTPs 3 µL
RNase Out 1 µL

各ステップ

各サンプルについて、ボルテックスして試薬を混和します。

各サンプルの合計量は56 µLとします。

0.5 mLエッペンドルフチューブ2本に28 µLずつ分注します。

1本のチューブは逆転写反応（MMLV RT 2 µLを添加）、もう1本は非逆転写コントロールとして、H₂O 2 µLを添加します。

各チューブに、上記のDNase処理したRNAを10 µL添加します。

ピペッティングにより十分に混和します。

すべてのサンプルを37°Cで1時間、次に95°Cで5分間インキュベートします。

後者のステップでは、残存する酵素（MMLV RTおよび残存するDNase）を完全に不活化します。

直ちにPCRに使用するか、翌日一番に-20°Cで保管します。

残りの逆転写マスターミックスに、調製するサンプルあたりMMLV RT 2 µLを添加します。

ボルテックスにより混和し、各サンプルについてチューブ1本あたり30 µLを分注します。
例えば、計10個のサンプルがある場合、10個すべてを逆転写しますが、DNase処理ステップが確実に実施されたことを確認するために、非逆転写コントロールに対して2～3個のサンプルを追加することができます。したがって、上記のマスターミックスに 7 または8を掛けます。 1X マスターミックスは2つのサンプル用です。

1つのグループから2～3つのサンプルをランダムに選択します。

1サンプルあたり28 µLを0.5 mLチューブに分注し、非逆転写コントロールを調製します。
それぞれにRNA 1 µgを添加し、DEPC処理H₂O 2 µLをさらに添加（任意）します。

すべてのサンプルを37°Cで1時間、次に95°Cで5分間インキュベートします。

直ちにPCRに使用するか、翌日一番に-20°Cで保管します。

その後、2つの非逆転写サンプルを分注します（各28 µL）。

MMLV RT 20 µL（サンプルあたり2 µL）をマスターミックスに添加します。
混合液をボルテックスし、チューブ1本あたり30 µLを10本に分注します。
それぞれに、対応するRNA 1 µg（10 µL）を添加し、インキュベートします。

後者のステップでは、残存する酵素（MMLV RTおよび残存するDNase）を完全に不活化します。

cDNA 第二鎖合成

cDNA第二鎖合成は、cDNA合成ワークフローにおける重要なステップであり、逆転写反応中に産生される一本鎖cDNAを二本鎖cDNAに変換します。このプロセスは、遺伝子発現解析、PCR増幅、クローニング、次世代シーケンシングなど、多くの下流分子生物学アプリケーションに不可欠です。高品質の二本鎖cDNAは、元のRNAテンプレートを安定かつ正確に表現し、遺伝子発現研究における頑健で再現性のある結果を可能にします。

合成反応後、フェノール-クロロホルム抽出またはカラムベースの精製などの方法を使用して生成物を精製し、酵素、塩、および残りの一本鎖核酸を除去します。このステップは、高感度のダウンストリームアプリケーションに適した高品質で精製されたcDNAを得るために不可欠です。

cDNA第二鎖合成の成功は、RNAテンプレートの品質と、最初の逆転写反応で使用される逆転写酵素の効率に大きく依存します。切断または不完全なcDNA断片の形成を防ぐためには、高いRNAの完全性と純度が不可欠です。 MMLV逆転写酵素などの高い忠実度と処理性を持つ逆転写酵素を使用すると、合成cDNAの精度と長さを向上させることができます。同様に、校正活性を有するDNAポリメラーゼを選択することで、二本鎖合成の忠実度を高め、DNA合成中のエラーのリスクを低減することができます。

cDNA第二鎖合成を成功させるための主な考慮事項には、以下が含まれます。

RNAの完全性：最終産物からRNA分解を防ぐために、cDNA合成を開始する前に、必ずRNAの純度と完全性を評価してください。
逆転写酵素の選択: cDNAの収量と精度を最大化するために、高忠実度、高処理性の逆転写酵素を選択します。
DNAポリメラーゼの選択：校正活性を持つDNAポリメラーゼの選択し、正確な二本鎖cDNA合成を保証します。
反応条件の最適化：温度、pH、バッファー組成を慎重にコントロールし、効率的なDNA合成をサポートし、RNA分解を防止します。
効果的な精製: フェノールクロロホルム抽出やカラムベースのキットなどの信頼性の高い精製方法を使用して、コンタミネーション物質のない高品質の二本鎖cDNAを分離します。

これらの要因に細心の注意を払い、cDNA第二鎖合成の各ステップを最適化することにより、研究者は高品質の二本鎖cDNAを生成し、正確な遺伝子発現解析やその他の分子生物学アプリケーションのための強力な基盤を築くことができます。

他の方法との比較

カラムベースのRNA抽出キットと比較して、このプロトコールで使用されるTRIzol^®法は費用対効果が高く、特に脂質が豊富な組織や線維組織から高品質のRNAを生成します。市販のRNA単離キットは、その利便性とさまざまなサンプルタイプとの互換性のために広く使用され、多くのラボで人気のある選択肢となっています。カラムキットは利便性と速度を提供しますが、TRIzol^® はサンプル材料の柔軟性を高め、RNA収率も向上します。逆転写の場合、このプロトコールは従来の酵素ベースのアプローチを使用し、ワンステップRT-PCRキットよりもカスタマイズ可能です。ワンステップキットは処理時間を短縮しますが、プライマーの選択と反応の最適化の柔軟性に欠けています。このプロトコールは、コスト、効率、コントロールのバランスを取り、幅広い研究ニーズに適しています。

アプリケーション

このRNA単離と逆転写プロトコールは、RT-PCR、qPCR、RNAシーケンシング、トランスクリプトームプロファイリングなどの遺伝子発現研究に広く適用できます。正確なRNA定量が不可欠である、発生生物学、がん生物学、神経科学、ウイルス学の研究をサポートします。このプロトコールは、遺伝子ノックダウンまたは過剰発現実験の検証、および感染細胞におけるウイルスRNAの検出にも適しています。培養細胞や組織を含むさまざまなサンプルタイプとの互換性により、塩基性および応用分子生物学研究の両方で汎用性の高いツールとなります。得られたcDNAをアーカイブして再利用することができ、実験の再現性を高めることができます。さらに、このプロトコールはcDNAライブラリ構築に使用され、包括的な遺伝子発現およびシーケンシング研究を可能にします。

デメリット

効果的ですが、このプロトコールにはいくつかの制限があります。 TRIzol^®法には、フェノールやクロロホルムなどの有害化学物質が関係しており、慎重な取り扱いと適切な廃棄物処理が必要です。 RNAの収量と純度は、サンプルの種類とユーザーの技術によって異なります。 RNAペレットの過剰乾燥または不完全なDNase処理は、下流アプリケーションに影響を与える可能性があります。さらに、プロトコールは、自動またはキットベースの方法と比較して時間がかかります。逆転写効率は、RNAの完全性とプライマーの選択によって影響を受ける可能性があります。したがって、徹底したRNA精製によるコンタミネーション物質の除去やダウンストリームアプリケーション用の高品質RNAの確保、RNAの定量と完全性評価など、厳格な品質管理ステップは、信頼性の高い結果を得るために不可欠です。

トラブルシューティング

RNA単離と逆転写における一般的な問題には、低RNA収量、分解したRNA、および不十分なcDNA合成が含まれます。 RNA収量が低い場合は、完全な溶解と均質化を確認し、試薬の鮮度を確認します。 RNAの分解は、RNaseのコンタミネーションに起因することがよくあります。RNaseフリーの消耗品を使用し、氷上で迅速に作業してください。ゲノムDNAコンタミネーションが持続する場合は、DNaseの処理時間または濃度を増加してください。 cDNA収量が低い場合は、RNAの完全性とプライマーの品質を確認してください。 cDNA合成または低RNA収量に問題がある場合は、RNAの完全性を評価して、RNAがダウンストリームアプリケーションに適していることを確認します。 RNAペレットの過剰乾燥は、再懸濁を妨げる可能性があるため避けてください。逆転写に進む前に、必ず分光光度計または蛍光光度計を使用してRNA濃度と純度を検証してください。