ファロイジン染色プロトコール
最適なコンジュゲートを選択するためのヒントを含む、 ファロイジン 色素コンジュゲートによる 染色 の詳細な手順。 ファロイジン 染色 は、固定細胞および組織におけるフィラメントアクチン（F-アクチン）の可視化に広く使用され、細胞骨格の組織および構造を高い特異性で明確に観察することができます。
その他のプロトコール
その他のプロトコール
F-アクチン染色キットを見る
当社のファロイジン-iFluor標識色素を見る
この プロトコール では、 F-アクチン の高親和性プローブとして蛍光 ファロイジンコンジュゲートを使用して、フィラメント状構造の高分解能イメージングを実現する方法を説明します1。 細胞やパラフィン包埋組織を含むホルムアルデヒド固定透過処理サンプルと互換性があり、接着タイプと 浮遊細胞 タイプの両方をサポートします。
この方法は、抗体ベースの 染色 ワークフローと組み合わせることができます。 最適化すると、バックグラウンド信号を最小限に抑えながら明るく光安定性の高い 蛍光 を発するため、アクチンフィラメントの信頼性の高い再現性のある可視化を必要とする細胞生物学、細胞骨格研究、 蛍光 顕微鏡でのアプリケーションに適しています。
はじめに
ファロイジンとは何ですか？なぜF-アクチンに結合するのですか？
ファロイジンは、F-アクチンに特異的に結合し、フィラメント構造を安定化し、正確な 蛍光ベースの可視化を可能にする 二重環状ペプチド 式です。 その特異性は、種間のアクチンの高度に保存されたアミノ酸配列から生じ、多様な生物系においてアクチンフィラメントへの一貫した結合を可能にする。
ファロイジン 染色に使用される蛍光色素は？
本 プロトコール では、 iFluor色素を含む蛍光色素に結合した ファロイジンを用いた 染色 について説明します。この色素は、FITCや ローダミンなどの従来の蛍光色素と比較して、輝度と光安定性を向上させます。 これにより、 蛍光 顕微鏡分析中の画像品質と信号安定性が向上します。
この プロトコール はどの研究分野をサポートしていますか？
この方法は、細胞骨格動態、細胞形態、および細胞内構造に関する研究をサポートする。 アクチンは 真核生物 で最も豊富なタンパク質の1つであることを考えると、この プロトコール には、実験条件にわたって再現性のある結果を保証するための調製、 染色、およびイメージングのための step-by-step ガイダンスが含まれています。
背景と原則
ファロイジン はどのようにアクチンフィラメントに選択的に結合しますか？
ファロイジンは、F-アクチンと高い親和性で結合し、フィラメント構造を安定化し、正確な可視化を可能にする、選択性の高い 二重環状ペプチド 式です。 動物細胞や植物細胞を含む幅広い種にわたってアクチンサブユニットと相互作用し、アクチンフィラメントの検出に広く適用可能になります2。
どの蛍光コンジュゲートが ファロイジン 染色に適合しますか？
染色 用途では、 ファロイジンは、FITC、ローダミン、 TRITC、 Alexa Fluor 488、または iFluor 488などの蛍光色素にコンジュゲートされます。 これらのコンジュゲートは、ホルムアルデヒド固定、透過化サンプル中のアクチンフィラメントの直接イメージングを可能にします。これには、培養細胞、組織切片、脱パラフィンパラフィン包埋標本が含まれます3。
染色 手順の主なステップは何ですか？
染色 手順には、メタノールを含まないホルムアルデヒドによる 固定 、Triton X-100を使用した 透過処理 、および ファロイジン コンジュゲートとのインキュベーションが含まれます。 透過化は、そうでなければ無傷の細胞膜によって保護される細胞内アクチンフィラメントへの ファロイジン のアクセスを可能にするために不可欠である。
ファロイジン の結合と色素の選択に影響を与える要因は何ですか？
ファロイジンはpH感受性であり、pHの上昇は重要なチオエーテル架橋を切断し、アクチンに対する結合親和性 還元 可能性がある。 マルチプレックス 染色では、抗体のインキュベーション中に ファロイジン を組み込むことができます。 結合体の選択では、輝度、光安定性、顕微鏡フィルターセットとの互換性を考慮する必要があります。iFluor色素は優れた性能を発揮します。
当社のiFluor色素のラインナップを見る
ステージ1 - 最適なファロイジンコンジュゲートを選択します。
必要な資材
-
ファロイジンコンジュゲート – メーカーのガイドラインに従って調製します。
- ヒント：1% BSA溶液を使用して、チューブに結合するファロイジンの量を最小限に抑えることが推奨されます。
- ヒント：ファロイジンコンジュゲートの至適濃度およびインキュベーション時間は、細胞タイプ、固定／サンプル調製条件、および／またはプローブに対する細胞／組織の透過性によって異なります。
-
PBS
-
メタノールフリーホルムアルデヒド
-
オプション：Triton X-100またはNP-40
-
封入剤 – 退色を抑えるため、Fluorosheildが推奨されます。 あるいは、PBS緩衝50%グリセロールを、退色防止剤であるp-フェニレンジアミンまたはN-propyl gallateと併用します。
-
任意：BSA、エタノールアミン、グリシン、DNA染色色素、lysopalmitoylphosphatidylcholine
各ステップ
最適なファロイジンコンジュゲートを選択します。
これらの色素は、FITCやローダミンなどの従来の色素よりも明るく、光安定性が高く、Alexa Fluor® 同様の性能を示すため、当社のファロイジン-iFluor色素標識をおすすめします。iFluor色素標識は、個々の試薬として、また完全なF-アクチン染色キットとしてご利用いただけます。
F-アクチン染色のコントロールとして、未標識のファロイジンを使用することができます。 色素標識済みのファロイジンの代替として、ビオチン標識済みファロイジンをストレプトアビジン色素コンジュゲートとともに使用することができます。
当社のファロイジン-iFluor全製品をご覧いただけます
ステージ2 - 細胞培養の調製
必要な資材
-
ファロイジンコンジュゲート – メーカーのガイドラインに従って調製します。
- ヒント：1% BSA溶液を使用して、チューブに結合するファロイジンの量を最小限に抑えることが推奨されます。
- ヒント：ファロイジンコンジュゲートの至適濃度およびインキュベーション時間は、細胞タイプ、固定／サンプル調製条件、および／またはプローブに対する細胞／組織の透過性によって異なります。
-
PBS
-
メタノールフリーホルムアルデヒド
-
オプション：Triton X-100またはNP-40
-
封入剤 – 退色を抑えるため、Fluorosheildが推奨されます。 あるいは、PBS緩衝50%グリセロールを、退色防止剤であるp-フェニレンジアミンまたはN-propyl gallateと併用します。
-
任意：BSA、エタノールアミン、グリシン、DNA染色色素、lysopalmitoylphosphatidylcholine
各ステップ
コンフルエンス（70–80%）に達するまで、黒色ウォール／クリアボトムの96ウェルプレートで細胞を増殖させます。
細胞は、ペトリディッシュ内のカバーガラス上で直接増殖させることもできます。
細胞培養培地を吸引します（細胞を除去しないよう注意します）。
PBSで1回洗浄します。
メタノールまたはアセトンを含有する固定液の使用は避けてください。これらはアクチン構造を破壊し、ファロイジン染色を妨げます。
懸濁細胞は、ポリD-リジンマイクロプレートまたはカバーガラスに接着し、接着細胞のプロトコールを用いて染色することができます。
必要な資材
-
ファロイジンコンジュゲート – メーカーのガイドラインに従って調製します。
- ヒント：1% BSA溶液を使用して、チューブに結合するファロイジンの量を最小限に抑えることが推奨されます。
- ヒント：ファロイジンコンジュゲートの至適濃度およびインキュベーション時間は、細胞タイプ、固定／サンプル調製条件、および／またはプローブに対する細胞／組織の透過性によって異なります。
-
PBS
-
メタノールフリーホルムアルデヒド
-
オプション：Triton X-100またはNP-40
-
封入剤 – 退色を抑えるため、Fluorosheildが推奨されます。 あるいは、PBS緩衝50%グリセロールを、退色防止剤であるp-フェニレンジアミンまたはN-propyl gallateと併用します。
-
任意：BSA、エタノールアミン、グリシン、DNA染色色素、lysopalmitoylphosphatidylcholine
各ステップ
必要なコンフルエンス（70–80%）に達するまで、細胞を増殖させます。
細胞を1,000 rpmで5分間遠心分離し、上清を吸引して細胞ペレットを保存します。
細胞ペレットをあらかじめ温めた（37°C）増殖培地に静かに再懸濁し、マイクロプレートまたはカバーガラスに移します。
細胞を除去しないよう細胞培養培地を慎重に吸引します。
- PBSで1回洗浄します。
時間を節約したい場合、懸濁細胞は、ポリD-リジンマイクロプレートまたはカバーガラスに接着し、接着細胞のプロトコールを用いて染色することができます。
ステージ3 - ファロイジンコンジュゲートによる培養細胞の染色
必要な資材
-
ファロイジンコンジュゲート – メーカーのガイドラインに従って調製します。
- ヒント：1% BSA溶液を使用して、チューブに結合するファロイジンの量を最小限に抑えることが推奨されます。
- ヒント：ファロイジンコンジュゲートの至適濃度およびインキュベーション時間は、細胞タイプ、固定／サンプル調製条件、および／またはプローブに対する細胞／組織の透過性によって異なります。
-
PBS
-
メタノールフリーホルムアルデヒド
-
オプション：Triton X-100またはNP-40
-
封入剤 – 退色を抑えるため、Fluorosheildが推奨されます。 あるいは、PBS緩衝50%グリセロールを、退色防止剤であるp-フェニレンジアミンまたはN-propyl gallateと併用します。
-
任意：BSA、エタノールアミン、グリシン、DNA染色色素、lysopalmitoylphosphatidylcholine
各ステップ
細胞を3–4%ホルムアルデヒド（PBS中）で室温で10–30分間固定します。
1% BSA（PBS中）で固定細胞を20–30分間プレインキュベートすると、染色が向上する可能性があります。
カバーガラスを染色する際は、蒸発を最小限に抑えるため、カバー付きの容器に入れて保管してください。
固定液を吸引し、細胞をPBSで2–3回洗浄します。
10 mMエタノールアミン（PBS中）［または0.1 Mグリシン（PBS中）］で5分間、過剰なホルムアルデヒドをクエンチングします。
0.1% Triton X-100 (0.1% NP-40 を代わりに使用可能)を固定細胞に添加して3–5分間インキュベートし、透過性を高めます。 次に、細胞をPBSで2–3回洗浄します。
細胞が健康に見えない場合、血清（2–10%）を添加して染色し、溶液を洗浄します。
メーカーの指示に従ってファロイジンコンジュゲートを希釈し（通常1:100～1:1,000）、暗所で室温で20–90分間細胞をインキュベートします。
染色後、細胞をPBSで2–3回すすぎます（洗浄1回につき5分間）。
希釈係数、希釈に用いた溶液、希釈期間は細胞株によって異なり、最適化が必要です。
蛍光を維持するために封入剤を添加します（カバーガラスを使用する場合はスライドを密封します）。
励起波長（Ex）／蛍光波長（Em）493/517 nmで細胞を観察します。
ファロイジン染色の迅速なワンステップアプローチは状況によっては効果的です。3.7%ホルムアルデヒド、50–100 µg/mL lysopalmitoylphosphatidylcholineおよびファロイジンコンジュゲートを4ºCで20分間インキュベートした後、3回洗浄し、封止します。
分析と解釈
蛍光 顕微鏡データの正確な分析は、アクチンフィラメントの組織とダイナミクスを解釈するために不可欠です。 画像取得後、特殊なソフトウェアを使用してフィラメント構造 突起 および定量化し、 アクチン結合タンパク質分布を評価し、細胞内アクチン配列を評価する4。
定量的測定には、フィラメントの長さ、密度、配向、および 蛍光 強度が含まれてもよく、これはアクチンの存在量および組織と相関する。 これらのパラメータは、様々な実験条件および治療下での細胞骨格構造の詳細な特徴付けを支持する。
従来の 蛍光 顕微鏡法における重要な制限は、回折限界であり、これは解像度を制限し、微細アクチン構造を不明瞭にする場合がある。 これは、ナノメートルスケールの解像度でアクチンフィラメントを可視化することを可能にする超解像度顕微鏡技術を使用して対処することができる5。
これらの高度なイメージングアプローチは、アクチンの動態や分子相互作用に対する深い洞察を提供し、細胞運動や遺伝子制御などのプロセスの研究をサポートします。 色素の選択、撮像パラメータ、および潜在的なアーチファクトを慎重に検討することが不可欠であり、実験群を比較するための統計解析も同様である。
他の蛍光顕微鏡法との比較
ファロイジン 染色 は、抗体ベースのアクチン 染色よりも高い特異性と迅速な処理を提供します。 交差反応を起こしたり、広範囲のブロッキングを必要とする抗体とは異なり、 ファロイジン はF-アクチンに直接かつ均一に結合し、ワークフローを簡素化し、再現性を向上させます。
FITCやローダミンなどの従来の染料は、iFluorや Alexa Fluorなどの新しい染料よりも光安定性が低く、一貫性と耐久性のある 蛍光 シグナルに推奨されています。 これらの特性は、長時間のイメージングおよび定量分析において特に重要です。
ウトロフィンまたはホルミンからのものなどのアクチン結合ドメインに基づく代替アクチンプローブは、アクチンフィラメントの生細胞撮像を可能にする。 対照的に、 ファロイジン 染色 は固定サンプルに限定されていますが、構造上の明瞭さとフィラメント組織の詳細な可視化を提供します。
この プロトコール は 免疫蛍光染色 ワークフローと互換性があり、アクチンやその他の細胞成分を同時に検出できます。 マルチプレックス実験では、アレ Alexa Fluor 568 コンジュゲートなどの蛍光標識二次抗体を使用して、アクチンフィラメントと共に追加の標的を可視化する。
アプリケーション
ファロイジン 染色 は、細胞骨格組織、細胞形態、運動性、細胞内輸送の研究に広く使用されています。 それは、細胞生物学、がん研究、神経科学、および発達生物学を含む分野にわたって適用され、多様な実験目的をサポートします。
この プロトコール は、ホルムアルデヒド固定被着体および 浮遊細胞の 染色 をサポートし、培養システムのアクチンフィラメントの可視化を可能にします。 細胞質の および核アクチン、ならびにストレス繊維および樹状脊椎などの特殊構造の調査を可能にする。
ファロイジン 染色 は、 蛍光 顕微鏡検査および抗体ベースのマルチプレックスイメージングと互換性があります。 薬物、遺伝子改変、または環境刺激によって誘発される構造的変化を検出し、細胞骨格タンパク質の構造の変化に対する洞察を提供するのに特に有用である。
さらに、この方法は、核アクチンフィラメントおよび関連構造の可視化をサポートし、核アクチン動態および核プロセスおよび細胞内制御におけるアクチンモノマーの役割に関する研究を促進する。
デメリット
ファロイジン 染色は固定サンプルに限定されており、毒性と無傷の細胞膜を通過できないため、生細胞イメージングに適用できません6。 安全性を確保し、試薬の完全性を維持するためには、 ファロイジン コンジュゲートの適切な取り扱いが不可欠です。
メタノールベースの固定液はアクチンフィラメントを破壊し、染色品質を損なうため、避ける必要があります。 濃縮 やインキュベーション時間などの最適な 染色 条件は、細胞の種類やサンプル調製によって異なり、経験的最適化が必要です。
蛍光強度は、撮像中の 退色 または過剰曝露によっても影響を受ける場合がある。 信号品質を維持し、アクチン構造を正確に可視化するには、適切な封入剤と慎重に制御されたイメージング設定が必要です。
トラブルシューティング
ファロイジン 蛍光 シグナルが弱いのはなぜですか？
ファロイジン 染色 でよく見られる問題には、 蛍光弱さ、細胞の状態の悪さ、および高いバックグラウンドシグナルがあります。 色素 濃縮 が不十分であったり、インキュベーションが不十分であったりすると、シグナル強度が低くなる可能性があります。これらのパラメータを調整して 染色 結果を改善する必要があります。
染色中に細胞の健康をどのように維持できますか？
細胞が不健康な場合、 2–10%の濃度の血清を 染色 および洗浄緩衝液に加えることは、処理中の生存率の維持に役立つ可能性がある。 最適なサンプル処理を保証することで、全体的な 染色 の一貫性と信頼性を向上させることができます。
顕微鏡設定はアクチンの視覚化にどのように影響しますか？
顕微鏡フィルターの設定が正しくないと、視覚化が損なわれる可能性があるため、 蛍光色素の 励起 および 放出 プロファイルとの互換性を検証する必要があります。 過度に強い核対比染色はアクチンシグナルを不明瞭にし、染料の 濃縮 や 露光時間を低下させることで減少する可能性があります。
染色 の信頼性を向上させるのは、どのような取り扱い方法ですか？
メタノールがアクチンの構造を破壊するため、メタノールを含まない固定剤を一貫して使用することは非常に重要です。 さらに、試薬の安定性を維持し、 染色 性能を維持するために、 ファロイジン コンジュゲートの繰り返し 凍結・融解 サイクルは避ける必要があります。
参考文献
- Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M. & Wieland, T. F-アクチンの ファロイジン 結合部位。 EMBO J. 4、 2815–2818 (1985)。
- Mahaffy, R. E. & Pollard, T. D. Arp2/3 複合体によるアクチンフィラメント分岐の形成に対する ファロイジン の影響。 生化学 47、 6460–6467 （2008）。
- グナセカラ、H. ら Phalloidin-PAINT: F-actin の定量的ナノスケールイメージングの強化。 バイオフィス J. 123, 3051–3064 (2024).
- McKayed, K. & Simpson, J. C. Actin in action: imaging approaches to study cytoskeleton structure and function. McKayed, K. & Simpson, J. C. Actinは、細胞骨格の構造と機能を研究するためのイメージングアプローチを研究している。 細胞 2、 715–731 （2013）。
- Huang, B., Bates, M. & Zhuang, X. 超分解能 蛍光 顕微鏡。 Annu. 改訂Biochem. 78、 993–1016 (2009)。
- マズルーム・ファルシバフ、H. et al.マズルーム・ファーシバフ、H. et al. 固定細胞におけるアクチンの超分解能イメージングのための生命体と ファロイジン の比較。 PLoS One 16 ページ ページ ページ、 e0246138 (2021)。