IHC抗原賦活化プロトコール
抗原賦活化の2つの方法、熱処理法（熱誘導抗原賦活法またはHIERとしても知られる）と酵素法について学びます。
その他のプロトコール
その他のプロトコール
抗原賦活化は、形態学的保存に一般的に使用される固定パラフィン包埋組織を含むホルマリン固定組織の抗原性を回復させる免疫組織染色（IHC）において重要なステップです。
この プロトコール は、熱誘導 エピトープ 抗原賦活化 活化 (HIER) や酵素賦活化などの抗原賦活化方法を対象とし、さまざまな組織タイプや抗原に対応します。 これらの技術は、固定中に形成されるタンパク質架橋結合を破壊し、抗体が効果的に結合することを可能にします。 プロトコールには、圧力鍋、電子レンジ、スチーマーを使用する手順、およびプロテアーゼを使用した酵素消化の手順が含まれます。
また、 突起を簡素化するために、調製済みのバッファーと汎用試薬キットも提供しています。 このガイドは、最適な染色結果を確実にし、さまざまな組織タイプと抗原の再現性のあるIHCワークフローをサポートします。
Universal HIER antigen retrieval reagent (10X)
Antigen Retrieval Buffer (100X Tris-EDTA Buffer, pH 9.0)
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はじめに
ホルマリン 固定 は組織形態を保持しますが、抗原をマスクすることができ、IHCで抗体にアクセスできなくなります。
抗原賦活化は、固定中に形成されたメチレン架橋を破壊することによって、このマスキングを逆転させます。 抗原賦活化 化の正確なメカニズムはまだ研究中であり、ホルムアルデヒド架橋の加水分解開裂、 エピトープ の展開、カルシウムイオン抽出など、複数の化学プロセスが関与している可能性があります。
このプロトコールは、熱または酵素のいずれかを使用した抗原賦活化に対する構造化アプローチを提供します。 選択される方法は、使用する組織の種類、抗原、および抗体によって異なり、最適な方法を選択するにはしばしば経験的検査が必要です。
このプロトコールは、IHCアプリケーションで高品質で特異的な染色を達成することを目標とする研究者にとって不可欠です。 また、バッファー調製のガイドラインや、回収 突起合理化するための機器の推奨も含まれています。
背景と原則
抗原賦活化は、固定組織におけるエピトープアクセシビリティの回復に基づきます。 抗原賦活化技術は、ホルマリン固定組織中の抗原をマスク解除するために使用される方法であり、免疫組織染色での検出の改善を可能にします。 ホルマリン固定により、抗原部位を不明瞭にする架橋結合が形成されます。
熱誘導抗原賦活法 (HIER) は、高温および特定のバッファーを使用してこれらの架橋結合を切断します。 最適なpHと組成のクエン酸塩、トリス、EDTAなどの適切なHIERバッファーとHIERバッファーを選択することは、組織損傷を最小限に抑えながら抗原賦活化効率を最大化するために不可欠です。
熱処理は、 固定中に変化した エピトープ 構造を復元し、それによって抗体結合を改善することができる。 酵素賦活化では、プロテアーゼを使用してマスキングタンパク質を消化します。 突起は酵素消化として知られ、 固定中に形成される架橋を破壊し、抗体へのアクセスを促進しますが、組織損傷や非特異的な 染色の危険性があります。
方法およびバッファーのpHの選択は抗原に依存し、経験的最適化を必要とすることが多くあります。 アブカムのプロトコールは再現性を重視しており、実験全体で一貫した結果が得られるように検証済みの試薬が含まれています。
すべての IHC検出キットを参照します。
信頼性の高い結果が得られる便利なバッファー
熱誘導抗原賦活化で頑健な結果を得るには、事前に調製された抗原賦活化バッファーを推奨します。 これには、一般的に使用される3つのバッファーがあります。クエン酸バッファーキット、 Tris-EDTAバッファーキット、 EDTAバッファーキット、 Trisバッファーキットからお選びください。
また、ほとんどの抗体に適合しており、複数のバッファーが不要となる Universal Heat-mediated Antigen Retrieval Reagentキット（当社の主要なPD-L1クローン28-8で使用）も提供しています。
または、独自のバッファーと溶液を準備し、以下の同じ推奨方法を使用できます。
熱誘導抗原賦活化用バッファー
以下の3種の溶液は、HIER用バッファーの中で最も一般的なものです。 データシートの情報がない場合、賦活化用バッファーの選択は試行錯誤が必要です。
クエン酸ナトリウムバッファー（10 mMクエン酸ナトリウム、0.05% Tween 20、pH 6.0）
- クエン酸三ナトリウム（二水和物）2.94 g
- 蒸留水 1 L
- 混合して溶解する。 1N HClでpHを6.0に調整します。
- Tween 20を0.5 mL加えてよく撹拌します。 室温で3ヵ月間保存可能、または
- 4°Cで長期保存可能
1 mM EDTA、pH 8.0
- EDTA 0.37 g
- 蒸留水 1 L
- NaOHでpHを8.0に調整します。
- 室温で3ヵ月間保存可能
Tris-EDTAバッファー（10 mM Tris base、1 mM EDTA溶液、0.05% Tween 20、pH 9.0）
- Tris 1.21 g
- EDTA 0.37 g
- 蒸留水 1 L
- 混合して溶解する。 pHを9.0に調整します。
- Tween 20を0.5 mL加えてよく撹拌します。 室温で3ヵ月間、または4°Cでより長期間保存可能。
ステージ1 - 熱誘導抗原賦活法（HIER）
熱誘導抗原賦活法は、圧力鍋、電子レンジ、野菜蒸し器を使用して実施されることが多いです。 ラボによっては、60°Cに設定したウォーターバスを使用し、スライドを賦活化溶液中で一晩インキュベートします。 これは、特に骨、軟骨、皮膚など、高温で加熱したときにスライドから落ちてしまう組織切片を扱う場合に有用です。
この手順では、スライドを金属製ラックに入れます。
免疫組織染色を行う前に、同じ組織切片のスライドを1、2、3、4、5分間賦活化して、賦活化時間を最適化するコントロール実験を推奨します。
必要な資材
- 家庭用ステンレス製圧力鍋
- ホットプレート
- 容器（約400–500 mL）、スライドラック付き
- 抗原賦活化バッファー（Tris/EDTA pH 9.0、クエン酸ナトリウムpH 6.0等）
各ステップ
1
適切な抗原賦活化バッファーを圧力鍋に添加します。
- 圧力鍋をホットプレートの上に置き、最大出力にします。
- 圧力鍋が沸騰するのを待っている間に、切片を脱パラフィンし、再水和します。
この時点では、圧力鍋の蓋を固定せず、上部に載せるだけにします。
2
沸騰後、スライドを水道水から圧力鍋に移します。
熱い溶液には注意してください。鉗子を使用してください。
3
メーカーの指示に従って圧力鍋の蓋をしっかりと閉じます。
4
圧力鍋が全圧に達した後、直ちに3分計ります。
5
3分経過後、ホットプレートの電源を切り、圧力鍋を空のシンクに置きます。
6
圧力放出弁を作動させ、圧力鍋の上に冷水を流します。
- 圧力が抜け次第、蓋を開けて、冷水を10分間、鍋の中に流します。
熱い溶液は慎重に取り扱ってください。
これにより、スライドを取り扱うのに十分な温度に冷却でき、高温にさらされた後に抗原部位が再形成されるようになります。
7
免疫組織染色プロトコールに進みます。
ステージ2 - 酵素抗原賦活法
酵素処理によって切片の形態にダメージを与えることがあるので、濃度と処理時間を検討する必要があります。 酵素溶液を組織に添加するには、少なくとも2つの方法があります。スライド上の組織に溶液を直接滴下する方法と、組織スライドのラックを酵素溶液の容器に入れる方法です。
最初の方法では試薬の使用量が少なくてすみますが、各スライドを個別に処理する必要があるため、インキュベーション時間を注意深くモニタリングして、すべてのスライドが同じ処理を受けていることを確認する必要があります。 このため、大量のスライドを酵素溶液の容器に浸せば、処理が容易になります。 自動染色システム（Ventanaなど）を使用する場合は、適切な酵素賦活化プロトコールをメーカーに問い合わせてください。
使用する酵素は抗体のデータシートに記載されています。 記載がない場合、トリプシンが、ホルマリン/PFA固定後に賦活化する必要があるさまざまな抗原に有用です。
酵素によっては活性に特定のバッファーや補因子を必要とするため、選択した酵素に関するメーカーのデータシートを必ずお読みください。
必要な資材
- 37°Cのウォーターバス
- スライドラックおよびスライドラック用の容器
- 酵素抗原賦活化用溶液（トリプシンの場合は、酵素賦活化のピペッティング法を参照）
各ステップ
1
使用する酵素の最適温度にウォーターバスを設定します。
- スライドラックを収納できる容器2つに超純水を入れます。
- 容器をウォーターバスに入れて温めます。
十分な量の水またはバッファーを使用してスライドを覆います。
2
切片を脱パラフィンし、再水和します。
- スライドを水の入った片方の容器に入れて温めます。
冷たいスライドを酵素溶液に入れると、溶液の温度が下がり、酵素活性が低下して、抗原部位の賦活化が不十分となります。
3
もう片方の容器の温水から酵素抗原賦活化用バッファーを調製します。
- その後、容器をウォーターバスに戻して溶液を再加熱します。
酵素の活性を損なわないよう、酵素抗原賦活化用溶液はできるだけ早く調製します。
この賦活化液の温度が戻ってから、スライドを入れます。
4
温めたスライドを酵素溶液に移し、10–20分間、断続的に穏やかに攪拌します。
- この後、スライドを取り出し、水道水を流しながら3分間、酵素を洗い流します。
免疫組織化学染色を行う前に、組織切片を酵素溶液中で10、15、20、25、30分間インキュベートして、賦活化時間を最適化する必要があります。
5
免疫組織染色プロトコールに進みます。
方法の比較
HIER抗原と酵素抗原賦活法は、特にパラフィン包埋組織切片を扱う場合、メカニズムと用途が異なります。 HIERは、クエン酸塩や Tris-EDTA などの熱やバッファーを使用して、より穏やかで一貫性があります。 PIERは、トリプシンやプロテイナーゼKなどの酵素を含む酵素溶液を使用して組織を消化し、抗原をマスク解除します。これは、より攻撃的で、組織損傷のリスクがあります。
HIERは、その制御された条件のためにほとんどの抗原に好まれますが、酵素抗原賦活法は、パラフィン包埋組織切片のエピトープの回復が困難な場合に有用です。 各抗原に対する最適なアプローチを決定するために両方の方法をテストし、信頼性と特異的な染色を確保することを推奨します。
抗原賦活化の最適化
抗原賦活化ステップの最適化は、一貫した高品質の免疫組織化学染色を達成するために不可欠です。 最適な抗原賦活化方法は、組織の種類、抗原の性質、および使用される一次抗体を含むいくつかの要因に依存します。 ホルマリン固定の期間や種類、組織検体の経年、バッファーの選択などの変数はすべて、エピトープ賦活化の有効性に影響を与える可能性があります。
熱誘導抗原賦活法では、組織形態を維持しながら抗原曝露を最大化するために、温度、加熱時間、冷却プロセスなどのパラメータを慎重に調整する必要があります。 実験間で賦活化方法を標準化することで、染色強度とバックグラウンド染色のばらつきを減らすことができます。これは、診断病理学や研究環境において特に重要です。
抗原賦活化プロトコールを体系的に最適化することで、ラボでは免疫組織化学染色の感度と特異性を高め、幅広い組織タイプと抗原に対して信頼性と再現性のある結果を得ることができます。
問題 | 考えられる原因 | への影響 染色 | ||
|---|---|---|---|---|
脱力または欠如 染色 | 未取得 | エピトープは依然としてマスクされ、抗体にアクセスできない | ||
高いバックグラウンド 染色 | 過剰取得 | 非特異的抗体結合の増加 | ||
スライドから組織を持ち上げる | 過度の加熱または長時間の回収 | サンプルの完全性の喪失 | ||
形態学的損傷 | 過剰 酵素消化 | 組織構造の歪み | ||
パッシー 染色 |
| 不規則な抗体結合および 染色 アーチファクト |
アプリケーション
ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織のIHCには、抗原賦活化が不可欠です。 抗体アクセスを回復させることで、細胞内および膜結合タンパク質の検出を可能にします。
抗原賦活化技術は、保存組織にも適用でき、抗原性を保つために凍結組織切片および凍結組織に適合させることができ、FFPEサンプルに代わるものを提供します。 アプリケーションには、がんバイオマーカーの検出、神経科学、病理学、および発達生物学が含まれます。
このプロトコールは、手動および自動染色ワークフローをサポートし、幅広い抗体と互換性があります。 検証済みのバッファーと試薬を使用することで、多様な研究環境において高い感度と特異性が保証されます。
デメリット
抗原賦活化は染色を強化しますが、限界があります。 過剰に賦活化すると、組織形態が損傷したり、特に高温や長時間の酵素消化で切片が欠損したりすることがあります。 バッファーのpHと賦活化時間は、抗原ごとに最適化する必要があります。
マイクロ波ベースのHIERは加熱が不均一になり、染色に一貫性がなくなることがあります。 酵素法は、強力な場合があり、正確なタイミングを必要とします。 アブカムは、条件を微調整し、ばらつきを最小限に抑えるために、コントロール実験を行うことをお勧めします。
トラブルシューティング
抗原賦活化における一般的な問題には、染色の弱さまたは欠如、高いバックグラウンド、および組織の剥離が含まれます。 これらは、不適切なバッファーpH、不十分な賦活化時間、または過熱に起因する可能性があります。 検証されたバッファーを使用し、温度を注意深くモニタリングし、スライドの乾燥を避けることをお勧めします。 酵素賦活化については、酵素活性を確保し、過消化を避けること。
トラブルシューティングのヒントには、バッファー組成の調整、抗原賦活化中の一貫して制御された加熱のための科学研究用電子レンジの使用、条件を最適化するためのタイムコース実験の実施が含まれます。
