Fura-2 AMイメージングプロトコール
このFura-2 AMイメージングプロトコールは、セントルイス大学のAmy Harkins教授から提供いただきました。
その他のプロトコール
その他のプロトコール
Fura-2, no-wash, ratiometric assay kitを見る
Fura-2 AMは、生細胞の細胞内カルシウム濃度を測定するために広く使用されているレシオメトリック蛍光色素です。 このプロトコールでは、Fura-2 AMイメージングの実行方法について説明し、試薬調製、細胞負荷、およびカルシウムイメージングのstep-by-stepな実行について詳しく説明します。 線維芽細胞、PC12細胞、胚性ニューロンなど、さまざまな細胞タイプに最適化されています。 この手順には、バッファー調製、細胞再播種、色素ローディング、およびイメージング設定が含まれます。 再現性と感度を考慮して設計されたこのプロトコールにより、研究者は高い時間分解能でカルシウム動態をモニタリングできます。 標準蛍光顕微鏡およびマイクロプレートリーダーと互換性があり、シングルセルおよびハイスループットアプリケーションの両方に適しています。
はじめに
カルシウムイオンは細胞シグナル伝達において重要な役割を果たし、神経伝達、筋肉収縮、ホルモン分泌などのプロセスに影響を与えます。 Fura-2 AMは、細胞透過性の高い高親和性カルシウム指標で、研究者が細胞内カルシウム変動を可視化して定量化できるようにします。 このプロトコールは、生細胞イメージング実験でFura-2 AMを使用するための信頼性の高い方法を提供します。 レシオメトリック特性を活用することで、プロトコールは色素のロードと光退色によるばらつきを最小限に抑えます。 GPCR活性化またはカルシウムチャネルの動態を研究する場合でも、このガイドは、さまざまな細胞タイプと実験条件にわたって正確で再現性のある結果を確実にします。
背景と原則
Fura-2 AMは、細胞膜に浸透できるFura-2色素の合成エステル化形態です。 Fura-2 AMは、カルシウムイメージングの精度と有用性を向上させるために開発されました。 細胞内に入ると、細胞エステラーゼはAM基を切断し、細胞内で活性色素を捕捉します。 染料は、複合体を形成することによってカルシウムイオンに結合し、これがその蛍光特性を変えます。 色素は、カルシウムに結合すると340 nm、結合していない時は380 nmという励起波長のカルシウム依存性シフトを示し、510 nmで蛍光を放出します。 このレシオメトリック特性により、色素濃度や細胞厚に関係なく、カルシウム濃度を正確に定量できます。 このプロトコールは、HBSSバッファーとBSAを利用して色素のローディングを促進し、バックグラウンド蛍光を最小限に抑え、イメージング中の最適なシグナル対ノイズ比を確保します。
ステージ1 - 試薬の調製
必要な資材
- Fura-2 AM（ab120873など）
- HBSS-1X（以下のレシピを参照）
- 50 mM KCl（以下のレシピを参照）
各ステップ
1
Fura-2 AMをDMSOと混和します。
- DMSO 50 µLを凍結乾燥Fura-2 AM 50 µgに添加し、1分間ボルテックスします。
遮光のため、ホイルに包み、-20oCで保管します。
2
Hank's緩衝塩類溶液 10X (HBSS-10X)を調製します。
- 1000 mLの場合、蒸留H20 850 mL（18 MΩ・cm）を使用し、以下の表の試薬を添加して攪拌します。
- 最終容量を1000 mLとします。
- 4°Cで保管します。
試薬 | 容量 |
|---|---|
NaCl（FW 58.44） | 80 g（137 mM） |
KCl（FW 74.55） | 4 g（5.4 mM） |
MgCl2-6H2O（FW 203.3） | 1g（0.5 mM） |
MgSO4-7H2O（FW 246.5） | 1g（0.4 mM） |
KH2PO4（FW 136.1） | 0.6 g（0.44 mM） |
Na2HPO4-7H2O（FW 268.1） | 0.9 g（0.34 mM） |
3
HBSS-1x溶液を調製します。
- 10X HBSS溶液（前のステップで調製）100 mLを蒸留H2 800 mLと混和します。
- 0.14 gの無水CaCl2（FW 111、1.3 mM）、1gのd-グルコース（FW 180.2、5.5mM）、および0.35 gのNaHCO3（FW 84.01、4.2 mM）を加える。
- 蒸留H2Oを加えて1000 mL（pH 7.4）とします。 4°Cで約1週間保管します。
4
50mM KCl溶液を調製します。
- 容量1 L、pH 7.35、約290-310 mOsm。 4°Cで保管します。
試薬 | 容量 |
|---|---|
NaCl（FW 58.44） | 5.0843 g（87 mM） |
KCl（FW 74.56） | 3.728 g（50 mM） |
MgCl2 (FW 203.3） | 0.2033 g（1 mM） |
CaCl2 について（認証済み容量ストックからの1 Mのストック） | 5 mL（5 mM） |
HEPES（FW 238.3） | 2.833 g（～12 mM） |
グルコース（FW 180.16） | 1.8016 g（10 mM） |
ステージ2 - 再プレーティング
各ステップ
実験の1～2日前に、35 mmの組織培養ディッシュに入れた、コラーゲンをコーティングしたカバーガラス（円形、ガラス製、エタノールで滅菌、乾燥）に細胞を再プレーティングします。
1
35 mmのディッシュを150 mmのペトリディッシュに入れます。このペトリディッシュは、マイクロインキュベーターとして、またインキュベーターと実験の間のキャリアとして使用します。
2
再プレーティング時は、ガラス製円形カバーガラスの中央に細胞を置き、イメージングを最適化させます。
3
細胞密度と再プレーティングの方法は経験的に判断し、洗浄および溶液の灌流によって細胞をガラスに付着させます。
ステージ3 - FURA-2 AMイメージング当日
必要な資材
- Fura-2 AM（ab120873など）
- イオノマイシン、遊離酸（例：ab120370）
- HBSS-1X
各ステップ
1
HBSSおよび50 mM K溶液を冷蔵庫から取り出し、機器の電源を入れ、検量線を作成します。
- 細胞がガラスにしっかりと接着していることを確認してください。
2
50 mL Falconチューブを2本取り、「HBSS」および「HBSS+BSA」とラベルを貼付します。
- 「HBSS」とラベルを貼付した50 mLチューブにHBSS容器からHBSSを注ぎ入れます。
3
HBSS+BSA溶液を調製します。
- BSA（脂肪酸フリー）約45 mgを量り、「HBSS+BSA」とラベルを貼付した空のチューブに添加します。
- 同チューブにHBSS 約45 mLを移し、大量の気泡が形成されないように静かに、ただしBSAを完全に混和させた後、静置します。
- BSAとHBSSの1 mg/mL混合液ができあがります。
4
Fura-2とHBSS+BSAを混和します。
- Fura-2 AMをDMSO 50 µL中で解凍し、室内灯を消して混和します。
- Fura洗浄後のタイミングに対し、イメージングのタイミングの都合がよくないため、一度にロードするのは2 mmディッシュのうち35枚のみとします。
- このFura-2/HBSS/BSA溶液は、細胞の入った35 mmディッシュ1枚あたり4-10µLを15 mL Falconチューブにピペットで移します（イメージング用の細胞中のFura-2 AM濃度が低いと、細胞内の緩衝能が低下します）。
- HBSS+BSA 4 mLをFura-2の入った15 mLチューブに添加します。
- インキュベーターからカバーガラスのディッシュを2枚取り出し、ベンチに置きます。15 mLチューブを高速で1分間ボルテックスします。
- HBSSおよびHBSS+BSAの2 mLチューブ50本をラックにセットします（すべてのFalconチューブの蓋を緩めます／取り外します）。
廃棄物容器を近くに置き、滅菌ピペットチップを開けて準備を整えます。
5
Furaをロードします。
- インキュベーターから2 mmディッシュを35枚取り出します。
- 1 mLの滅菌ピペットチップを用いて、細胞の入った35 mmディッシュ1枚からすべての培地を取り除き、廃棄物容器に捨てます。
- 同じチップを用い、HBSS 1 mLを取り、細胞に静かに添加します。プレーティングした細胞を乱さないよう、側面に沿って慎重に置きます。
- 添加したHBSS 1 mLを吸い取り、廃棄物容器に捨てます。同じチップで次のHBSS 1 mLを取り、細胞に静かに置きます。
- 添加した溶液を再度吸い取り、チップを廃棄します。
- 新しい滅菌ピペットチップを用いて、HBSS+BSA 1 mLをピペットで取り、静かに洗浄し、添加した溶液を廃棄します。
- 同じピペットチップを用いてさらに2回繰り返し、HBSS+BSAで細胞を3回洗浄します。
- 同じチップを用いて、1分間ボルテックスしたFura+HBSS+BSA 1 mLを直ちに添加します。
- さらにFura-2 AM 1 mLを取り、細胞に添加し、カバーガラスのディッシュの蓋に時刻を記載したラベルを貼付します。 2枚目のディッシュも同様に繰り返します。
- 通常は45分間ロードします。ロードする時間は、HBSS+BSA 2 mLあたりFura-2 AM 4-10 µLと同様に、変更が必要になる場合があります。 CO2/37°Cインキュベーター内に2枚のディッシュを戻し、45分間ロードします。
廃棄物容器を近くに置き、滅菌ピペットチップを開けて準備を整えます。
6
細胞を洗浄します。
- 2枚のディッシュを取り出し、新しい滅菌チップを用いてFura-HBSS+BSA混合液1 mLを静かに抜き取って廃棄し、次にもう1 mLを抜き取ります。
- 新しいピペットチップを用いて、HBSS 1 mL（HBSS+BSAではない）で細胞を3-4回、各回とも静かに洗浄し、洗浄液を廃棄します。
- 4回目の洗浄後、HBSS 1 mLを残し、さらにHBSS 1 mLを添加します。 時刻を記載したラベルを貼付し、インキュベーター内に戻して30～45分間置きます。
7
イメージングを実施します。
- 細胞の入った1枚目のカバーガラスを約25分間洗浄し、チャンバー内のイメージング装置にセットアップします。
- イメージング時間は最長7-15分とし、インキュベーターから次のディッシュを取り出します。
- 静止時のCa2を測定するため、記録チャンバーでは細胞をHBSSで絶えず灌流させます。 細胞を刺激するには、試験溶液、50 mM K溶液、電気刺激等のいずれかを使用します。
- 刺激には、K＋濃度の高い溶液（対応する一価）として20 mM、40 mMおよび60 mMのKCl溶液も使用でき、各回ともNaClが等量のKClに置換されます。
- イメージング用のポジティブ・コントロールを得るには、作用濃度20 µMのイオノマイシン（ab120370、遊離酸5 mg、DMSO中で20 mMに混和）を使用し、灌流している間、適切な量をチャンバー内に入れます。
すべての実験は暗所で実施してください。
8
1日を通して続けるには、最初のセットを洗浄するのとほぼ同時に、次の2枚のカバーガラスのロードを開始することが推奨されます。
- ロード／洗浄を記録し、カバーガラスの交換に要する時間を把握し、イメージング全体の実行にかかる時間を把握して、時間を守ることができます。
適切なインジケータの選択
最適なカルシウム指標を選択することは、細胞内カルシウム濃度を正確に測定するための基本的なステップです。 Fura-2、Fluo-4およびIndo-1など、さまざまなカルシウム指標が利用可能であるため、研究対象の細胞の種類、目的の放出波長、カルシウム結合イベントの検出に必要な感度など、実験の具体的な要件を考慮することが重要です。 Fura-2のようなレシオメトリックカルシウム指標は、不均一な負荷、染料の漏れ、または光退色がデータ品質を損なう可能性がある実験に特に有利です。 これらのインジケータはレシオメトリック読み出しを提供し、さまざまな厚さおよび形態の細胞にわたるカルシウム濃度のより信頼性の高い測定を可能にします。 対照的に、Fluo-4などのレシオメトリックでない指標は、より簡単なワークフローを提供しますが、色素の負荷と細胞体積の違いを説明するために追加のキャリブレーションが必要になる場合があります。 カルシウム指標を実験デザインに注意深く一致させることで、細胞内カルシウム濃度の正確で再現性のある測定を保証し、細胞カルシウム動態に関するより有意義な洞察を得ることができます。
Fluo-4アッセイキットを見る
Indo-1 AM、蛍光Ca2+インジケータを見る
Fluo-5 AM、蛍光標識試薬（Fluo-4アナログ）を見る
インジケータのプロパティ
カルシウム指標の特性を理解することは、カルシウムイメージング実験を最適化し、細胞内カルシウム濃度の正確な測定を確実にするために不可欠です。 例えば、Fura-2は、Quin 2のような以前の染料と比較して大幅に改善された蛍光特性で有名であり、研究者は高い感度を維持しながら、より低い指標濃度で実験を行うことができます。 Fluo-4などのカルシウム指標の発光スペクトルは、生細胞内のカルシウムレベルの微妙な変化の検出を可能にします。 Fura-2のようなレシオメトリックインジケータは、2つの励起波長（340 nmおよび380 nm）で比率測定を可能にすることによって、精度のさらなる層を提供し、染料濃度、細胞の厚さ、および光退色の変化を補正するのに役立ちます。 この内蔵キャリブレーションにより、蛍光放出の変化が細胞内カルシウム濃度の変化を直接反映します。 適切なスペクトル特性と結合特性を持つインジケータを選択することで、研究者は特定の細胞タイプと実験条件に合わせてプロトコールをカスタマイズし、最終的により正確で再現性のある結果を得ることができます。
スペクトル特性
カルシウム指標のスペクトル特性は、細胞内カルシウム濃度の変化の検出における有効性の中心です。 各インジケータは、カルシウム結合に応答して変化するユニークな励起および放出スペクトルを有し、カルシウムレベルをリアルタイムで監視するための高感度な手段を提供します。 例えば、Fura-2は励起波長のカルシウム依存性シフトを示し、カルシウムに結合した場合は380 nm、結合しなかった場合は340 nmで励起されますが、蛍光放出は510 nmで一貫しています。 このレシオメトリックアプローチは、これら2つの励起波長での蛍光放出を比較することによってカルシウム濃度の正確な測定を可能にし、不均一な染料の負荷または細胞の厚さなどの要因を効果的にコンペンセーションします。 Fluo-4のような他の指標は、カルシウム結合イベントを信号化するために放出スペクトルの変化に依存します。 カルシウム指標のスペクトル特性を理解し活用することで、研究者はイメージングプロトコールを最適化し、適切なフィルターセットを選択し、細胞内カルシウム濃度の測定値が関心のある細胞イベントに敏感で特異的であることを保証することができます。
他の方法との比較
Fluo-4やCalbryte 520などの単一波長色素と比較して、Fura-2 AMはレシオメトリック測定により優れた精度を提供し、不均一な色素のローディングや光退色によるアーチファクトを低減します。 遺伝的にコード化されたカルシウム指標（GECI）とは異なり、Fura-2 AMはトランスフェクションを必要としないため、初代細胞や短期実験に最適です。 GECIは長期追跡を提供しますが、Fura-2 AMは急速なカルシウム流束を伴う急性アッセイに優れています。 さらに、Fura-2アッセイの洗浄不要バリアントは、ハイスループットスクリーニングのワークフローを簡素化します。
アプリケーション
Fura-2 AMイメージングは、カルシウムシグナル伝達を研究するために神経科学、心臓学、薬理学で広く使用されています。 神経伝達物質、イオノフォア、電気パルスなどの刺激に反応してカルシウム流入をリアルタイムで監視できます。 このプロトコールは、GPCRスクリーニング、シナプス活性分析、およびカルシウムチャネル特性評価のアプリケーションをサポートします。 また、さまざまな細胞株におけるカルシウム恒常性に対する薬物効果の評価にも適しています。 Fura-2 AMは共焦点顕微鏡およびマイクロプレートリーダーとの互換性があり、生細胞における定性的および定量的カルシウムイメージングの両方のための汎用性の高いツールです。
デメリット
その利点にもかかわらず、Fura-2 AMイメージングには限界があります。 色素の光に対する感受性は暗い条件下でのイメージングを必要とし、その細胞内バッファー能力は、過剰になるとカルシウム動態に影響を与える可能性があります。 プロトコールでは、一貫した色素のローディングと洗浄手順を確実に行うために、正確なタイミングと処理が必要です。 さらに、複数の洗浄およびインキュベーション期間の必要性により、スループットが制限される場合があります。 Fura-2 AMは、染料の漏れや光退色による長期イメージングには適していません。 反復する研究またはin vivo用途では、遺伝的にコード化されたインジケータがより好適である場合があります
トラブルシューティング
Fura-2 AMイメージングでよく見られる問題には、色素のローディング不良、バックグラウンド蛍光の高値、カルシウムシグナルの不整合などがあります。 ローディングを改善するには、細胞を十分に接着させ、新しく調製したHBSS+BSAバッファーを使用してください。 混合中に泡ができないようにし、一貫したインキュベーション時間を維持します。 蛍光が弱い場合は、色素濃度を確認し、調製中に光に曝露していないか確認してください。 細胞剥離により信号が不均一になることがあります。再播種密度と洗浄技術を最適化してください。 キャリブレーションエラーの場合、装置設定を確認し、イオノマイシンを使用して標準曲線を作成します。 染色の完全性を保つため、必ず暗所で撮像を行ってください。
データ解析と解釈
正確なデータ分析と解釈は、Fura-2のような分子プローブを用いたカルシウムイメージング実験から意味のある情報を抽出するために重要です。 レシオメトリックカルシウム指標の特徴である比率測定では、蛍光比を正確な細胞内カルシウム濃度に変換するために慎重なキャリブレーションが必要です。 キャリブレーションは通常、既知のカルシウムバッファーとイオノフォアを使用して標準曲線を生成し、比率値が細胞内の実際のカルシウムレベルに対応するようにします。 データを分析する際は、不均一な荷重、染料の漏れ、光退色の影響などの潜在的なアーチファクトを考慮することが重要です。これらはすべて、カルシウム濃度測定の信頼性に影響を与える可能性があります。 最新のデータ分析ソフトウェアと組み合わせた高度なイメージングアプリケーションとフローサイトメトリー技術により、これらの測定の精度と再現性が大幅に向上しました。 キャリブレーション、データ取得、および解析のベストプラクティスに従うことで、研究者は自信を持ってカルシウムシグナルを解釈し、幅広い細胞タイプおよび実験条件にわたる細胞内カルシウム動態と細胞機能の間の複雑な関係を明らかにすることができます。