タンパク質の除去
干渉タンパク質をサンプルから除去する過塩素酸（PCA）沈殿法の手順をご覧いただけます。
その他のプロトコール
その他のプロトコール
Deproteinizing Sample Preparation Kit – PCAを見る
この除タンパク質プロトコールは、過塩素酸 (PCA) 沈殿を使用して生体試料からタンパク質を除去するための信頼性の高い方法を提供します。 総タンパク質抽出は、多くのサンプルタイプにとって重要な前駆ステップであり、このプロトコールはこのような抽出プロセスに従うか、または補完するように設計されています。 この技術は、小分子分析用のサンプルを調製し、正確で干渉のない結果を得るのに不可欠です。 プロトコールには、タンパク質の沈殿、サンプルの中和、回収という3つの主要な段階があります。 血清、組織ホモジネート、細胞ライセートなど、さまざまなサンプルタイプと互換性があります。 使いやすさと再現性を考慮して設計されたこのプロトコールは、ATP、cAMP、抗酸化物質の定量などの下流アプリケーションをサポートします。
はじめに
ほとんどの研究では、特に小分子の分析において、生化学アッセイにおける一般的な課題としてタンパク質干渉が報告されています。 サンプル調製にはさまざまな抽出方法がありますが、PCA 沈殿はタンパク質の除去に特に効果的です。 この除タンパク質プロトコールは、タンパク質除去のための確立された方法であるPCA沈殿を使用することによってこの問題に対処します。 代謝産物の定量や酵素アッセイを行う研究者に特に有用です。 シンプルでスケーラブルな手順に従うことで、ユーザーは幅広い生体サンプルで一貫した除タンパク質を達成できます。 このプロトコールは、手動ワークフローとキットベースのワークフローの両方に最適化されており、日常的なラボでの使用に適しています。
背景と原則
除タンパク質は、生化学アッセイのサンプル調製において重要なステップです。 タンパク質の抽出は、分析用のサンプルを準備する最初のステップであることが多いため、DNAや塩などのコンタミネーション物質が下流アプリケーションに干渉する可能性があります。 このプロトコールは、PCA を使用してタンパク質を沈殿させ、その後遠心分離によって分離します。 PCA はタンパク質を除去するだけでなく、小分子分析物を安定化し、下流分析の完全性を維持します。 PCAの沈殿は、タンパク質だけでなく、タンパク質の分離と分析を妨げる可能性のある核酸、特にDNAも除去するのに効果的です。 沈殿後、サンプルは水酸化カリウム（KOH）を使用して中和され、アッセイ条件との適合性を確保します。 塩および混沌作用物質の除去も、アッセイの分解能および再現性を改善するために重要です。 この方法は、その効率、簡便性、および分析物の安定性を維持する能力のために好まれます。 ろ過や酵素消化と比較して、PCA沈殿は、除タンパク質に対するより迅速で再現性の高いアプローチを提供します。
資材
- 4 M過塩素酸（PCA）、氷冷
- 2 M KOH、氷冷（中和剤）
- 微量遠心機（4°Cに設定し、あらかじめ冷却しておく）
- 氷
- 微量遠心機用チューブ
ステージ 1 - タンパク質の沈殿
各ステップ
1
製品のプロトコールに記載されているとおりにサンプルを調製します。
- ホモジネートし遠心分離した後、透明なタンパク質サンプルが得られます。
- サンプルを氷上に置いておきます。
2
ホモジネート溶液中で最終濃度1 MになるようにPCAを添加し、短時間ボルテックスして十分に混和します。
タンパク質濃度の高いサンプルでは、より多くのPCAが必要な場合があります。
3
サンプルを氷上で5分間インキュベートします。
- 冷却遠心分離機を用いて、サンプルを13,000 x gで2分間遠心分離します。
- 上清を新しいチューブに移します。
分析物の性質によっては、PCA中のサンプルを-70°Cで凍結し、この段階で最長1ヵ月間保管することができます。
ステージ 2 - サンプルの中和
各ステップ
1
上清の体積の34%に相当する氷冷した2 M KOHをサンプルに添加（例：サンプル100 µLに対して2 M KOH 34 µLを添加）して上清を中和し、短時間ボルテックスします。
- これによりサンプルが中和され、過剰なPCAが沈殿します。
- ガス（CO2）が発生する可能性があるため、サンプルチューブの空気を抜いてください。
2
中和後、pHが6.5 - 8.0であることが非常に重要です（サンプル1 µLをpH紙でテストします）。
- 必要に応じて、0.1M KOHまたはPCAでpHを調整します。
3
冷却遠心分離機を用いて、サンプルを13,000 x gで15分間スピンします。
- 上清を回収します。
これでサンプルからタンパク質が除去されて中和され、PCAが除去されました。 このサンプルはアッセイに直接ご使用いただけます。
ステージ3 - サンプルの回収
タンパク質を除去したサンプルは元の濃度から希釈されます。 以下の式を用いて、最終サンプルの希釈係数を算出することができます。
元の濃度（%）=（当初のサンプルの容量 / 当初のサンプルの容量 + PCAの容量 + KOHの容量）× 100
サンプルの回収
サンプル回収段階は、特に化学分析とin vitroバイオアッセイを組み合わせたサンプル調製において、サンプル調製プロセスの重要な部分です。 最初の抽出および除タンパク質ステップの後、生物学的に関連のある化合物およびスパイクした遺伝毒性化合物が正確な分析のために保持されるように、クリーンで濃縮された形態でサンプルを回収することが不可欠です。 遠心分離、ろ過、蒸発などの技術は、過剰な溶媒を除去してサンプルを濃縮するために一般的に使用され、化学分析とバイオアッセイ試験の両方に適した溶液になります。
他の方法との比較
PCAベースの除タンパク質プロトコールは、タンパク質除去と検体安定化という2つの機能で際立っています。 トリクロロ酢酸 (TCA) 沈殿法と比較して、PCAは低刺激で、高感度分子の保存に適しています。 固相抽出と比較すると、PCA沈殿はワークフローが単純化され、機器への負荷が少なくなりますが、固相抽出は回収率が高く、特に環境水サンプルから幅広い分析物を抽出する場合に、より広範な化学的適合性を提供します。 10 kDaのカットオフ膜を使用するなどのろ過法は、タンパク質の最大98%を除去することができますが、より時間がかかり、機器に依存します。 酵素消化は効果的ですが、変動性をもたらし、追加の精製ステップを必要とする可能性があります。 代替抽出方法は、DMSOなどの有機溶媒を利用することが多いですが、下流の化学分析およびin vitroバイオアッセイとの互換性を確保するために慎重に選択する必要があります。 PCA沈殿、固相抽出、有機溶媒ベースの抽出を含む各方法の性能は、回収および検出効率を評価するためにスパイク化合物を使用して評価することができます。 PCA沈殿は、最小のサンプル損失で約95%のタンパク質除去を達成し、幅広いアッセイと互換性があり、多くの研究者にとって好ましい選択となっています。
アプリケーション
除タンパク質は、小分子定量用のサンプルの調製に広く使用されています。 ATP、cAMP、グルタチオン、グリコーゲン、および抗酸化物質を測定するアッセイに適しています。 血清、尿、組織ホモジネート、または細胞ライセートを扱う研究者は、その汎用性から利益を得ることができます。
本プロトコールは、in vitroバイオアッセイアプリケーションと高い互換性があり、ER CALUX、AR CALUX、GR CALUX、PR CALUXアッセイなどの幅広いバイオアッセイをサポートし、環境および生体サンプルにおける特定の内分泌受容体の活性化およびアゴニスト活性を検出します。 また、コメットアッセイやエイムズ変動試験などの遺伝毒性試験にも適しており、DNA損傷や変異原性の可能性を検出します。 このプロトコールにより、研究者は、表面水やその他のサンプルタイプの生物学的に関連のある化合物を、サンプルを化学的に分析し、バイオアッセイからの予測応答と比較することができます。 さらに、バイオアッセイにおけるアンタゴニスト効果の検出をサポートし、包括的な水質評価のための強力なツールボックスの一部として使用できます。
本プロトコールは、がん研究、代謝研究、および薬理学的スクリーニングにも適用されます。 比色法キットや蛍光分析キットなど、さまざまなアッセイフォーマットとの互換性により、学術研究室や産業研究室で貴重なツールとなります。 クリーンで安定したサンプルを確保することで、分析結果の信頼性が向上します。
デメリット
効果的ではありますが、PCAの除タンパク質プロトコールにはいくつかの限界があります。 これには、過塩素酸や水酸化カリウムなどの腐食性試薬の慎重な取り扱いが必要です。 プロトコールは、酸性または塩基性条件に敏感な分析物には適していない場合があります。 プロセス中のサンプル希釈は、アッセイ感度に影響し、補正因子を必要とする可能性があります。 さらに、アッセイの干渉を避けるためには、正確なpH調整が不可欠です。 ユーザーは、再現性を維持するために、適切な遠心分離と温度管理を確保する必要があります。 これらの検討事項にもかかわらず、プロトコールは、適切な予防策と併用した場合、ほとんどの小分子解析の堅牢なオプションであり続けます。
トラブルシューティング
PCA 除タンパク質プロトコールの一般的な問題には、不完全なタンパク質沈殿、pH調整の誤り、遠心分離中のサンプル損失などがあります。 タンパク質が上清に残留する場合は、PCA濃度を上げるか、またはインキュベーション時間を延長します。 pH逸脱は、KOH添加の精度を確認し、pH紙で確認します。 チューブを慎重に通気することで、中和中の過剰なガス形成を軽減できます。 サンプル回収率が低い場合は、遠心分離機の設定を確認し、チューブが事前に冷却されていることを確認します。 希釈エラーは、提供された式を使用して修正できます。 アブカムのテクニカルサポートと詳細なキット説明書は、プロトコールの課題を解決するための追加のガイダンスを提供します。
アブカムの除タンパク質サンプル調製キットは、工業的または診断的使用を意図したものではなく、研究目的にのみ推奨されます。