クロマチン・プロファイリング技術ChIC/CUT&RUN（Chromatin Immuno-Cleavage/Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease）は、DNAとタンパク質の相互作用の解析に使用されます。 ChIP-seqでは固定細胞を超音波処理してクロマチンを断片化しますが、ChIC/CUT&RUN-seqでは酵素（pAG-MNase）を使用します。

pAG-MNase酵素で、目的タンパク質に対する抗体を標識します。融合タンパク質は、最適な発現および精製を確実にするために特別に設計されたコード配列によってコードされます。融合タンパク質構造の概略図は、その機能的ドメインおよびタグを含み、これらの修飾を説明するためにしばしば使用されます。次に、免疫沈降法を用いて、目的タンパク質を含むクロマチン断片を精製することができます。この手順後、DNA断片を精製し、配列を解析（シーケンシング）します。シーケンシングの結果から、目的タンパク質が相互作用するDNA領域を決定することができます。 融合タンパク質と共に導入されたE. coli DNAは、正規化のためのスパイクインコントロールとして機能します。 E. coli DNAのキャリーオーバーに基づくキャリブレーション戦略により、サンプル間の正確な正規化と比較が可能になります。

CUT&RUNの概要

CUT&RUNは、遺伝子発現の研究と、クロマチンレベルで遺伝子発現を調節するメカニズムを変革した最先端の技術です。従来の方法とは異なり、CUT&RUNは、研究者が少数の細胞からであっても、驚くべき感度でタンパク質とDNAの相互作用をプロファイリングすることを可能にします。この方法は、融合タンパク質であるプロテインA-プロテインG ミクロコッカスヌクレアーゼ（pAG-MNase）を活用し、ターゲット転写因子またはクロマチン関連タンパク質に対する抗体によって、特定のクロマチン領域に向けられます。活性化されると、pAG-MNaseは結合部位付近のDNAを切断し、切断された断片を上清に放出します。次に、これらのDNA断片を抽出して配列決定し、分子生物学における遺伝子調節を理解するために重要なタンパク質-DNA相互作用の高解像度マップを提供します。

背景と原則

CUT&RUNのコア原理は、未固定の透過処理細胞におけるクロマチンのターゲット切断です。このプロセスは、転写因子などのDNA関連タンパク質に特異的に結合する一次抗体を用いた細胞のインキュベーションから始まります。抗体の適合性を高めるために、融合タンパク質、プロテインA-MNaseまたはハイブリッドプロテインA-プロテインG-MNaseのいずれかを導入し、幅広い抗体種の認識を可能にします。融合タンパク質またはハイブリッドタンパク質が抗体結合タンパク質に結合されると、カルシウムイオンの添加はMNaseを活性化し、これが目的タンパク質に近接してDNAを切断します。結果として生じる切断された断片は上清に放出され、DNA抽出および配列決定の準備が整います。この合理化されたアプローチは、ルーチンのエピゲノミクスプロファイリングをサポートし、さまざまな抗体や細胞タイプとの互換性を維持しながら、ハイスループット研究の高効率、再現性、スケーラビリティを提供します。

ステージ 1 - 細胞の採取とビーズの調製

必要な資材

ConA磁気ビーズ（1反応あたり10 µL）
PBS
細胞サンプル（1反応あたり2.5 x 10⁵）
洗浄バッファー（20mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、0.5 mMスペルミジン、プロテアーゼ阻害剤カクテル）
結合バッファー（20 mM HEPES pH 7.5、10 mM KCl、1 mM CaCl₂、1 mM MnCl₂）
遠心分離機
磁気ラック

各ステップ

1時間

1

細胞を採取し、氷冷したPBS 3–4mLで懸濁させます。

2

細胞を計数し、1反応に必要な数の細胞を採取します。

当社では、HeLa細胞を1反応あたり2.5×10⁵個使用します。ただし、各細胞株に対して最適化が必要な場合があります。
血球計数装置を使用した細胞の計数方法については、当社のプロトコールをご覧いただけます。

3

洗浄バッファーを調製します。

使用前にプロテアーゼ阻害剤カクテル（例：ab65621）を添加します。

4

細胞を洗浄バッファーで3回洗浄します。

洗浄バッファー1 mLを細胞に添加します。
細胞を600 x gで3分間、スピンダウンします。
上清を除去し、計3回洗浄を繰り返します。

5

ConA磁気ビーズを結合バッファーに入れ、ConA磁気ビーズ懸濁液を調製します。

ビーズは、1反応あたり10 µLを使用します。
磁気ラック上で、ビーズを結合バッファー1 mLで洗浄します。
1反応あたり結合バッファー10 µLにビーズを再懸濁します。

6

細胞を活性化ビーズに結合させます。

細胞とビーズを室温で20分間混和し、4分ごとに静かに混ぜます。

7

溶液から細胞が結合したビーズを分離します。

チューブを磁気ラックに1～2分間置きます。
上清を廃棄し、ビーズを保管します。

ステージ 2 - 透過処理および抗体の結合

必要な資材

洗浄バッファー（20mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、0.5 mMスペルミジン、プロテアーゼ阻害剤カクテル）
0.5M EDTAストック溶液
5%ジギトニンストック溶液
抗体バッファー（ステップ1を参照）
ChIC/CUT&RUN-seq検証済み抗体
水平回転式シェーカー
磁気ラック

約12時間

各ステップ

1

抗体バッファーを調製します。

EDTAおよびジギトニンストック溶液を洗浄バッファーで希釈し、最終濃度0.2 mM EDTAおよび0.05%ジギトニンとします。
使用前にプロテアーゼ阻害剤カクテル（ab65621）およびジギトニン（ab141501）を添加します。

2

ビーズを抗体バッファーに再懸濁します。

同じチューブで複数の反応を行う場合、1反応あたり約100 µLで再懸濁し、別のチューブに分注します。

3

抗体をビーズミックスに添加します。

推奨希釈倍率は抗体のデータシートに記載されています。
水平シェーカーで4°Cで一晩インキュベートします。

ConAビーズの乾燥を防ぐため、水平でインキュベーションしてください。

ステージ 3 - pAG-MNaseの結合

必要な資材

pAG-MNase
洗浄バッファー（20 mM HEPES、150 mM NaCl、0.5 mMスペルミジン、プロテアーゼ阻害剤カクテル、0.05%ジギトニン）
5%ジギトニンストック溶液
ジギトニン洗浄バッファー（ステップ2を参照）
水平回転式シェーカー
磁気ラック

所要時間 = 約1時間15分

各ステップ

1

溶液から抗体が結合したビーズを分離します。

チューブを磁気ラックに1～2分間置きます。
上清を廃棄し、ビーズを保管します。

2

ジギトニン洗浄バッファーを調製します。

ジギトニンストック溶液を洗浄バッファーで希釈し、最終濃度0.05%ジギトニンとします。
使用前にプロテアーゼ阻害剤カクテル（ab65621）およびジギトニン（ab141501）を添加します。

3

ビーズをジギトニン洗浄バッファーで2回洗浄します。

1反応あたりジギトニン洗浄バッファー200 µLをビーズに添加します
チューブを磁気ラックに1分間置きます。
上清を廃棄し、ビーズを保管します。
洗浄を計2回繰り返します。

4

ビーズをpAG-MNase溶液とインキュベートします。

ビーズをジギトニン洗浄バッファー50 µLに再懸濁します。
pAG-MNaseを添加して最終濃度700 ng/µLとします。
130 rpmで水平に振とうしながら、室温で1～2時間インキュベートします。

ConAビーズの乾燥を防ぐため、水平でインキュベーションしてください。

ステージ 4 - CUT&RUNでのクロマチンターゲットの消化

必要な資材

低塩濃度のバッファー（20 mM HEPES pH 7.5、0.05%ジギトニン、0,5 mMスペルミジン）
インキュベーションバッファー（3.5 mM HEPES pH 7.5、10 mM CaCl₂、0.05%ジギトニン）
磁気ラック

約40分

各ステップ

1

溶液から抗体が結合したビーズを分離します。

チューブを磁気ラックに1～2分間置きます。
上清を廃棄し、ビーズを保管します。

2

低塩濃度のインキュベーション・バッファーおよび洗浄バッファーを調製します。

使用前にジギトニン（ab141501）を追加してください。
バッファーを氷上に置きます。

3

ビーズをジギトニン洗浄バッファーで2回洗浄します。

1反応あたりジギトニン洗浄バッファー200µLをビーズに添加し、5分間インキュベートします。
チューブを磁気ラックに1分間置きます。
上清を廃棄し、ビーズを保管します。
洗浄を計2回繰り返します。

4

ビーズを低塩濃度のバッファーで洗浄します。

1反応あたり低塩濃度のバッファー200 µLをビーズに添加し、5分間インキュベートします。
チューブを磁気ラックに1分間置きます。
上清を廃棄し、ビーズを保管します。

5

氷冷したインキュベーション・バッファーでビーズをインキュベートし、クロマチンを消化します。

インキュベーション・バッファー100 µLを添加し、インキュベーションの途中で混和しながら氷上で15分間インキュベートします。
チューブを磁気ラックに1分間置きます。
上清を廃棄し、ビーズを保管します。
インキュベーション・バッファーはCa²イオンを含有しており、pAG-MNase酵素を活性化してDNAを切断します。インキュベーション時間の最適化が必要な場合があります。

ステージ 5 - DNAの溶出およびシーケンシング

必要な資材

反応停止バッファー（20 mM EGTA、170 mM NaCl、0.05%ジギトニン、50 µg/mL RNAse A、25 µg/mLグリコーゲン）
サーモミキサー
磁気ラック
抽出、品質管理、ライブラリー調製キット（市販品）

約35分

各ステップ

1

ビーズを反応停止バッファーでインキュベートします。

氷冷した反応停止バッファー100 µLを添加します。
ビーズを37°Cで30分間、700 rpmで振とうしながらサーモミキサー内でインキュベートします。

これにより、反応を停止させ、消化されたDNA断片を溶出させます。

2

断片を回収します。

チューブを磁気ラックに1分間置きます。
上清を新しいチューブに分注します。

上清にはDNA断片が含まれています。

3

DNAを抽出し、シーケンシングの準備をします。

市販の抽出、品質管理、ライブラリー調製キットは、メーカーの指示に従って使用します。

4

DNA断片をシーケンシングのために送付します。

CUT&RUNの用途

CUT&RUNは、分子生物学の多用途ツールとして急速に成長し、研究者はクロマチン関連現象を幅広く調査できるようになりました。転写因子結合部位のマッピング、ヒストン修飾のプロファイリング、ゲノム全体のクロマチンアクセシビリティの評価に特に強力です。これらのアプリケーションは、哺乳類細胞や植物細胞を含む多様な生物系における遺伝子調節、細胞分化、エピジェネティクスな修飾の複雑さを解明するために不可欠です。 CUT&RUNは、がんなどのヒト疾患において、エピジェネティック・ランドスケープの詳細な分析を可能にし、主要な調節要素と潜在的な治療ターゲットの特定に役立ちます。限られた細胞数から高分解能データを生成する能力により、稀な細胞集団や遺伝子発現の動的変化の研究に最適です。

他の方法との比較

従来のクロマチン免疫沈降法 (ChIP) 技術と比較して、CUT&RUNにはいくつかの大きな利点があります。出発物質がはるかに少ないため、限られた細胞サンプルや単一細胞での実験に適しています。この方法は、より高い感度と特異性を提供し、バックグラウンドノイズを低減し、真のタンパク質-DNA相互作用の検出精度を高めます。重要なのは、CUT&RUNは、クロスリンクアーチファクトをもたらし、結果を偏らせる可能性のあるホルムアルデヒド固定の必要性を排除することです。しかし、この技術は、高品質で特異的な抗体の可用性に依存しており、特定のゲノム領域は、依然として分析において課題を呈する可能性があります。全体として、CUT&RUNはクロマチン研究の多くのアプリケーションにおいてChIPよりも大きな進歩を示しています。

データ処理と分析

CUT&RUNシーケンシングデータの解析には、遺伝子調節とエピジェネティクスな修飾に有意義な洞察を抽出するために設計された一連のバイオインフォマティクスステップが含まれます。ペアエンドIlluminaシーケンシングの後、リードは参照ゲノムにアラインされ、タンパク質-DNA相互作用の正確な位置を特定します。次に、ピークコーリングアルゴリズムを使用して、転写因子およびヒストン修飾の領域に対する結合部位を特定します。正確な定量を確実にし、シーケンシング深度の変動を考慮するために、大腸菌DNAなどのスパイクインDNAを内部コントロールとして添加することができます。このキャリブレーション戦略は、データを正規化し、クロスマッピングの問題を回避するのに役立ちます。 Bowtie2やMACS2などの一般的なソフトウェアツールはデータ処理を容易にし、他のゲノムデータセットやエピゲノミクスデータセットとの統合は規制状況の包括的なビューを提供します。この堅牢な分析フレームワークにより、研究者は遺伝子発現とクロマチン動態の根底にある分子メカニズムを明らかにすることができます。