クロマチン免疫沈降法 用哺乳類組織調製 (ChIP)
この プロトコール では、哺乳類組織からクロマチンがどのように調製され、その後 クロマチン免疫沈降法 （ChIP）に使用することができます。
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組織プロトコールからのこのクロマチン調製は、下流のクロマチン免疫沈降法(ChIP) アプリケーションに適した、さまざまな組織サンプルから高品質のクロマチンを抽出するための検証済みで再現性のあるアプローチを提供します。 このワークフローは、組織調製を最初のステップとして開始し、次に最適化された架橋結合、組織解離、細胞溶解、クロマチンの断片化が続きます。これは、肝臓、脳、脂質含有量の高い脂肪組織、その他の複雑な組織などの困難なサンプルタイプに合わせて調整されます。
クロマチン免疫沈降法の紹介
クロマチン免疫沈降法 (ChIP) は、生体組織内のエピジェネティクスな調節とタンパク質-DNA相互作用を研究するための中心的な技術です。 組織からの信頼性の高いクロマチン調製は、ChIP実験の成功に不可欠であり、科学者は基本的な分子生物学技術を使用してヒストン修飾、転写因子の占有率、クロマチンのアクセシビリティを調べることができます。 組織プロトコールからのクロマチン調製は、初期の組織処理から免疫沈降の準備が整った微細なクロマチンまでの直接的なワークフローを提供することにより、可変細胞密度、内因性ヌクレアーゼ活性、豊富なバックグラウンドタンパク質など、組織サンプルに特有の課題を克服するために開発されました。 このプロトコールは、クロスリンクおよびネイティブのChIPワークフローの両方との互換性を考慮して設計されており、クロマチン研究でタンパク質間相互作用を捕捉するために不可欠な、サンプルの損失を最小限に抑え、バックグラウンドを低減し、重要なタンパク質-DNA相互作用を保持するように設計されています。 ChIP中のこれらの複合体の安定化には、タンパク質架橋とクロマチン結合が不可欠です。
背景と原則
組織からの効果的なクロマチン調製は、正確で再現性のあるChIPアッセイの基礎となります。 コア原則は、生物学的相互作用のスナップショットをキャプチャするために、通常はホルムアルデヒド架橋結合を介して天然タンパク質-DNA複合体を安定化させることです。 ホルムアルデヒドは、主にin vivo架橋結合中にリジン残基と反応し、タンパク質-DNAおよびタンパク質間相互作用の効率的な捕捉を可能にします。 クロスリンク、組織解離および細胞溶解の続いてクロマチンが放出されます。分解は、ワークフロー全体を通してプロテアーゼ阻害剤を組み込むことによって最小化されます。 機械的および酵素的なせん断 (超音波処理またはミクロコッカスヌクレアーゼ) は、下流のChIP-qPCRおよびChIP-seq試験での分離に重要な最適なクロマチン断片サイズを生成します。 クロマチンの収量と品質は、下流のChIPアプリケーションに不可欠です。 当社の推奨アプローチは、組織質量、バッファー組成、せん断条件などの変数を標準化し、これにより組織タイプ間で信頼性の高い比較を可能にするプラットフォームを確立します。 低温と迅速な処理を維持することで、クロマチンの完全性を維持できます。
ChIPまたは抗体ごとに肝組織30 mgの使用が推奨されます。 ただし、この量は他の組織では異なる場合があります。 組織の正確な量は、タンパク質の存在量、抗体親和性、クロスリンクの効率によって異なります。
このプロトコールは、各ChIPアッセイにクロマチン5-15 µgを用いる場合に最適化されています。 正確なクロマチン濃度は、X-ChIPアッセイの開始前に組織タイプごとに決定する必要があります。 また、正確なノーマライゼイションとピーク検証を確実にするために、ChIP-seqワークフローでは、インプットDNAを定量し、コントロールとしてインプットサンプルを含めることも重要です。 当社のクロスリンク・クロマチン免疫沈降法（X-ChIP）プロトコールは、以下のクロマチン調製後にご利用ください。 プロテアーゼ阻害剤は、すべての溶液（PBS PMSF 10 µL/mL、アプロチニン1 µL/mL、ロイペプチン1 µL/mLなど）に添加する必要があります。
このプロトコールは、Henriette O’Geen氏、Luis G. Acevedo氏、Peggy J. Farnham氏のご厚意により提供いただきました。
資材：
- FA溶解バッファー
- 50 mM HEPES-KOH pH 7.5
- 140 mM NaCl
- 1 mM EDTA pH 8
- 1% Triton X-100 または 1% NP-40
- 0.1%デオキシコール酸ナトリウム
- 0.1% SDS
- プロテアーゼ阻害剤（使用直前に加える）
ステージ1 - クロスリンク
各ステップ
1
凍結した組織を氷上で解凍します。
- 組織の量によっては、この手順に数時間を要する場合があります。
- 組織はドライアイスの上に置いたペトリディッシュ内で切断してください。
プロテアーゼによるサンプルの分解を防ぐため、組織を低温に保ち、凍結組織サンプルの温度が高くならないようにすることが重要です。 サンプルは常に氷上に置き、すべての手順を迅速に行って解凍を最小限に抑えてください。
2
カミソリ刃を2枚使用して、凍結組織または新鮮組織を細かく切り刻みます。
- 切片の大きさは1-3 mm3とします。
3
組織を15 mLのコニカルチューブに移します。
- 組織を移す前後に空のチューブの重量を測定し、利用可能な組織の量を算出します。
4
ドラフトチャンバー内でクロスリンク溶液を調製します。
- 組織1 gあたりPBS 10 mLを使用します。
- ホルムアルデヒドを最終濃度1.5%になるまで添加し、チューブを室温で15分間回転させます。 ホルムアルデヒドの割合とクロスリンク時間の長さは、異なる組織に対して最適化する必要があるかもしれません。
ホルムアルデヒドは危険物質であるため、このステップはドラフトチャンバー内で実施する必要があります。
5
グリシンを最終濃度0.125 Mになるように添加して、クロスリンク反応を停止させます。
- 続けて室温で5分間回転させます。
6
組織サンプルを100 × g、4°Cで5分間遠心分離します。
7
培地を吸引し、氷冷したPBS 10 mLで洗浄します。
- 100 × g、4°Cで5分間遠心分離し、洗浄バッファーを廃棄します。
複数回の凍結・解凍は避けてください。
この段階で組織を液体窒素中で瞬間凍結し、-70°Cで保存することもできます。
すぐに使用する場合、出発物質1 gあたり10 mLの冷却したPBSで組織を再懸濁し、氷上に置きます。
ステージ2 - 組織解離
各ステップ
1
Becton Dickinson社製組織粉砕機Medimachineを用いて、単細胞懸濁液を作製することができます。
- 処理する組織1 gあたり処理用容器Medicon（50 µm）を2つ使用します。
2
1 mLピペットチップを切断して開口部を大きくします。
3
組織50-100 mg（塊3-4個）にPBS 1 mLを添加し、再懸濁させます。
4
この溶液をMediconに加え、組織を2分間粉砕します。
5
18ゲージのブラント針と1 mLシリンジを挿入してMediconから細胞を回収します。
-
- 氷上のコニカルチューブに細胞を回収します。
6
すべての組織を処理するまで、ステップ2から繰り返します。
7
顕微鏡で細胞懸濁液を確認し、単細胞懸濁液が得られていることを確認します。
さらに粉砕が必要な場合、PBSをさらに組織に添加し、すべての組織が均一な懸濁液になるまでステップ2-5を繰り返します。
8
10分間、300 × g、4°Cで遠心分離します。
次のステップのために細胞ペレットの量を測定／推定します。
9
上清を注意深く吸引し、ペレットをFA溶解バッファーに再懸濁します。
- 溶解バッファーは細胞1x107個あたり750 µLとすることが推奨されます。
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組織の選択と準備
適切な組織サンプルの選択と調製は、クロマチン免疫沈降法 (ChIP) 実験を成功させるための基本的なステップです。 クロマチン構造の完全性とタンパク質-DNA相互作用の保存は、クロマチン抽出前の組織の取り扱い方法に大きく依存します。 研究者は、新鮮、凍結、またはホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) サンプルを使用できますが、それぞれに ChIP アッセイの性能に関する独自の考慮事項があります。
- 新鮮組織: クロマチン免疫沈降法チップワークフローには新鮮組織が最適です。クロマチン免疫沈降法チップワークフローは、即時固定を可能にし、天然タンパク質-DNA複合体を保持し、分解を最小限に抑えます。 迅速な処理により、高品質のクロマチン抽出とタンパク質とDNAの相互作用を確実に検出できます。
- 凍結組織：新鮮組織が利用できない場合、凍結組織は堅牢な代替物です。 クロマチン構造をロックし、タンパク質-DNA結合を維持するために、採取後すぐに組織を液体窒素中で急速冷凍してください。 ChIPの前には、新鮮組織をミラーリングするプロトコールに従って、凍結組織を慎重に解凍して処理し、クロマチンの収量が一定になるようにします。
- FFPE 組織: FFPE 検体は長期安定性があるため、臨床および保存研究で広く使用されています。 しかし、固定プロセスはクロマチン抽出を複雑にし、多くの場合、タンパク質-DNA複合体の収率の低下とより困難な回収をもたらします。 Chrom-EX PEなどの特殊なプロトコールは、FFPE組織サンプルからのクロマチン免疫沈降法を強化するために開発されました。 本プロトコールはFFPE組織には使用しないこと。
ChIPアッセイの成功を最大化するには、正常細胞とがん細胞における遺伝子制御の研究、ヒストン修飾のプロファイリング、ゲノム領域全体にわたる転写因子結合のマッピングなど、組織の選択と調製を慎重に行うことが不可欠です。
安全上の注意
クロマチン免疫沈降法を実施する場合、プロトコールには危険化学物質および潜在的にバイオハザードとなる組織サンプルが含まれるため、安全性が最重要となります。 以下の注意事項を遵守することで、安全な検査室環境を確保できます。
- ホルムアルデヒドの取り扱い：ホルムアルデヒドは有毒で揮発性です。手袋、白衣、安全ゴーグルなど、適切な個人用保護具（PPE）を着用しながら、必ず認定されたドラフトチャンバーで取り扱ってください。 ホルムアルデヒド廃棄物は、施設および地域の規制に従って廃棄してください。
- 生体有害物質：組織検体、特にヒトまたは動物由来の検体には、感染性物質が含まれている可能性があります。 手袋、白衣、および眼の保護を常に使用し、生物学的物質の取り扱いおよび廃棄についてはバイオセーフティガイドラインに従ってください。
- 化学物質の廃棄：溶解バッファー、架橋結合試薬、有機溶媒を含むすべての化学物質は、現地の環境および安全規制に従って廃棄してください。 危険な化学物質を排水管に決して流さないでください。
これらの安全ガイドラインに従うことで、研究者はリスクを最小限に抑え、クロマチン免疫沈降プロトコールの安全な実行を確保することができます。
他の方法との比較
このプロトコールで概説されているように、組織からのクロマチン調製は、従来の細胞ベースの方法とは一線を画す最適化された架橋およびせん断戦略を採用しています。 培養細胞のプロトコールとは異なり、組織ベースの調製は、不均一な構造、可変タンパク質レベル、および効果的な組織解離技術の必要性を考慮する必要があります。 溶解およびせん断の前に，機械的解離（例，Medimachineまたはダウンス型ホモジナイザーの使用）が必要になることが多くあります。 酵素によるMNase消化などの別の断片化法と比較して、機械的な超音波処理は、複雑な組織や繊維性組織に対して優れた再現性を提供します。 MNaseはヌクレオソームレベルの分解能を提供しますが、配列バイアスをもたらし、組織特異的なクロマチンアクセシビリティに敏感です。 このプロトコールは、断片化効率とタンパク質-DNA複合体の保存のバランスを取り、バックグラウンドを最小化し、高いシグナル対ノイズ免疫沈降を可能にする、両アプローチのベストプラクティスを統合します。
アプリケーション
組織から調製される高品質のクロマチンは、標的化研究とゲノムワイド研究の両方を含む、高度なエピジェネティクス研究に不可欠です。 組織プロトコールのクロマチン調製は、ChIP-qPCR、ChIP-seq、ヒストン修飾マッピングなどのアプリケーションで広く利用されており、転写因子の結合、クロマチンリモデリング、さまざまな組織タイプ間の調節因子の同定を詳細に解析できます。 その使用は、発生生物学、疾患エピジェネティクス（癌、代謝、神経障害など）、および組織特異的遺伝子制御を調査する研究にまでおよびます。 冷凍アーカイブからのクロマチンの信頼性の高い調製は、臨床サンプルに関する後ろ向き研究もサポートしています。 一貫した収率とクロマチン断片サイズを提供することで、このプロトコールは次世代シーケンシングプラットフォームおよびエンリッチメント分析との互換性を保証します。 研究者は、合理化された実験ワークフロー、再現可能なChIP結果、複雑な組織環境での微妙な規制事象を調査する能力から恩恵を受けます。
デメリット
このプロトコールでは組織からクロマチンを分離できますが、組織ベースのChIP実験に固有の重要な制限事項に注意してください。 クロマチン抽出の成功は、組織タイプ、サンプルの鮮度、および架橋結合効率によって異なり、時には特定の組織に対するプロトコールの最適化を必要とします。 特に線維性および脂肪性組織では、不完全な細胞溶解または組織の不均一性により、高いバックグラウンドレベルが生じる可能性があります。 抗体の特異性と品質への依存は、依然として一般的なボトルネックであり、過剰または過少固定はクロマチン収率と免疫沈降感度の両方を損なう可能性があります。 DNAせん断には、高分子量断片の損失やエピトープマスキングを防ぐために、綿密な最適化が必要です。 さらに、組織ベースのプロトコールの入力要件は、細胞培養よりも高くなることが多く、非常に稀なまたはアーカイブされた材料を使用した研究を制限する可能性があります。 最後に、一部の下流アプリケーションでは、ベースペア分解能または標準プロトコールに匹敵するシングルセル感度が必要とされ、継続的な技術的改良の必要性が強調されます。
トラブルシューティング
組織サンプルからのクロマチン調製で最適な結果を得るには、一般的なトラブルシューティングポイントに注意深く対処してください。 高品質、新鮮、または適切に保管された凍結組織を使用し、効果的で迅速なクロスリンクを確保してタンパク質とDNAの分解を最小限に抑えます。 クロマチンの完全性を保つため、すべてのステップの間、特に解離と溶解の間、常にサンプルを低温に保ちます。 クロマチン収量が低い場合は、組織質量、溶解効率、プロテアーゼ阻害剤の鮮度をレビューします。 細胞の完全な解離と、理想的なフラグメントサイズ範囲 (200–700 bp) 内の十分なクロマチンの断片化を確認することで、過剰なバックグラウンドまたは低ChIP濃縮をトラブルシューティングします。 抗体の性能が低い場合は、コントロールChIPアッセイで抗体の特異性を検証し、必要に応じて濃度を調整します。 アッセイの効率をベンチマークするには、陰性および陽性のChIPコントロールを使用してください。 可変結果に遭遇した場合は、超音波処理またはMNase条件を最適化し、電気泳動によってフラグメント分布を分析します。