α-シヌクレイン・タンパク質用チオフラビンT（ThT）アッセイ・プロトコール
活性α-シヌクレインモノマーおよびチオフラビンTへの凝集結合をアッセイするためのプロトコール。
その他のプロトコール
その他のプロトコール
α-シヌクレイン濃度測定用ELISAキットを見る
チオフラビンT、蛍光細胞透過性アミロイド結合ベンゾチアゾール塩
α-シヌクレインは、シナプス機能やパーキンソン病やレヴィー小体型認知症などの神経変性疾患に関与する神経タンパク質です。 α-シヌクレインアッセイは、神経変性疾患の初期段階における変化の検出に有用であり、早期診断と介入に役立ちます。
このα-シヌクレインアッセイプロトコールは、疾患進行におけるこのタンパク質の役割を調査する研究者を支援するために設計されています。 これらのアッセイは、パーキンソン病の研究に関連する遺伝子変異、環境曝露、およびミトコンドリア機能を含む、パーキンソン病および他の神経障害の危険因子を研究するために使用されます。
疫学研究では、神経変性疾患を発症する確率を推定するために生涯リスクを使用することが多くあります。 研究アプリケーションには、空間パターンおよび神経画像バイオマーカーの変化の研究、ならびにタウ病理、タウ凝集、および脳脊髄液レベルなどの追加のバイオマーカーも含まれます。
ThTは、蛍光細胞透過性アミロイド結合ベンゾチアゾール塩です。 染料として、in vitroおよびin vivoでスタックβシートを可視化するために使用されます。 ThTの結合は、励起最大（385nm～450nm）および放出最大（445nm～482nm）のシフトを誘発します。 水に溶けやすく、血液脳関門を通過する能力は限られています。
ThT放出曲線は、10 μMの活性α-シヌクレイン凝集体（ab218819）を100μMの活性α-シヌクレインモノマー（ab218818）と混合した場合（水色）、100 μMの活性α-シヌクレインモノマーを10 μMのコントロールα-シヌクレイン凝集体と混合した場合（紫色）、または10 μMのコントロールα-シヌクレインモノマー（ab218817）を100 μMの対照α-シヌクレイン凝集体と混合した場合（濃い青色）と比較して、経時的に蛍光の増強を示します（α-シヌクレインタンパク質凝集と相関）。
このプロトコールで使用する製品
方法
各ステップ
dH2O中にて1 mMチオフラビンT（ThT）ストック溶液を調製します（新たに調製、0.2 μmシリンジフィルターでろ過）。
- 蒸留水にて新たに調製します。
- 0.2 µmシリンジフィルターでろ過します。
ThTをPBS（pH 7.4）で希釈します。 各ウェルの最終ThT濃度は25 μM（1mM ThT溶液25 μL～PBS 975 μL）とします。
α-シヌクレインのアリコートは、使用直前に室温で解凍してください。これにはモノマーと凝集体の両方が含まれます。
適切なウェルに10 μMの凝集体または100 μMのモノマーのいずれかを加えます。
このステップで添加するものは、凝集体かモノマーかによって異なります。
プレートを密封し、 37°Cで振とうインキュベーターに入れます。振とうインキュベーターを 600 rpmで遠心します。
蛍光マイクロプレートリーダーを用いてThTの蛍光を測定します。
- リーダーを励起450nmおよび発光485nmに設定する必要があります。
- 37°Cで1時間から最長72時間まで測定します。
神経変性疾患における役割
アルツハイマー病、パーキンソン病、その他の認知症を含む神経変性疾患は、世界的に健康問題が拡大していることを示しています。 これらの障害は、神経細胞の進行性変性を特徴とし、記憶喪失、認知機能低下、運動機能障害などの症状を引き起こします。 タウやα-シヌクレインなどのタンパク質の異常な凝集は、正常な脳機能を破壊する神経変性疾患の病因の中心です。 タンパク質凝集のメカニズムを理解することは、効果的な疾患修飾療法を開発し、認知症および関連する状態の世界的な影響を低減するために不可欠です。 進行中の疾患研究は、診断、治療、予防に対する新たなアプローチの緊急の必要性を強調し続けている。
タンパク質凝集と疾患
タンパク質凝集は、アルツハイマー病やパーキンソン病を含む多くの神経変性疾患の特徴です。 これらの状態では、アミロイドβやα-シヌクレインなどのタンパク質がミスフォールディングして蓄積し、脳細胞の機能を損なう有毒なタンパク質凝集体を形成します。 これらの凝集体は脳脊髄液で検出でき、ますます血液サンプル中でも検出され、早期診断と疾患モニタリングのための貴重なバイオマーカーとなります。 哺乳類細胞の研究では、タンパク質の凝集が神経機能障害に寄与するだけでなく、疾患進行の停止または回復を目的とした新しい治療法のターゲットを提供することが示されています。 α-シヌクレイン凝集体の検出などの高感度アッセイは、神経変性疾患におけるタンパク質凝集とその役割の理解を深め、診断と治療戦略の改善への道を開く上で役立ちます。
臨床的関連性および診断
アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患の診断は依然として複雑なプロセスであり、臨床評価、バイオマーカー分析、高度な画像化の組み合わせが必要となることが多くあります。 アミロイドβやタウなどの髄液中のバイオマーカーは、血液検体とともに、疾患の病理や進行に関する重要な情報を提供します。
他の方法との比較
質量分析は詳細な構造的洞察を提供しますが、このプロトコールの単純さとアクセシビリティに欠けています。 このアッセイは精度と実用性のバランスを取り、ルーチンのラボ使用や大規模な研究に適しています。 標準プレートリーダーとの互換性と最小限のハンズオン時間により、使いやすさがさらに向上します。
当社のα-シヌクレインELISAキットは、血清、血漿、および細胞ライセート中のα-シヌクレインを定量するための合理化されたアプローチを提供し、一方、チオフラビンTアッセイは凝集力学に関する洞察を提供します。 これらのプロトコールは、パーキンソン病患者の研究、縦断的研究デザイン、パーキンソン病と多系統萎縮症の鑑別診断に使用されます。 また、アルツハイマー病や認知症の研究や常染色体優性アルツハイマー病の遺伝子研究にも応用されています。
アプリケーション
これらのα-シヌクレインアッセイは、神経変性疾患の研究、特にパーキンソン病、アルツハイマー病、レヴィー小体型認知症の研究で広く使用されています。 ELISAキットは、ヒト血清、血漿、細胞抽出物中のα-シヌクレインの定量に理想的で、バイオマーカーの発見と薬剤開発をサポートします。 チオフラビンTアッセイは、タンパク質凝集動態の研究、凝集阻害剤のスクリーニング、治療ターゲットの検証に適しています。
デメリット
非常に効果的ですが、これらのアッセイにはいくつかの制限があります。 チオフラビンTアッセイは、凝集研究に有用ですが、異なる凝集種を区別したり、構造分解能を提供したりしない可能性があります。 さらに、蛍光測定値は、プレートリーダーの設定およびインキュベーション条件の影響を受ける可能性があります。 研究者は、特定のサンプルタイプと実験目標についてアッセイ条件を検証する必要があります。
トラブルシューティング
不適切なThT調製または温度変動により、蛍光が一致しない可能性があります。 常にThT溶液をろ過し、37°Cで一貫した培養を維持します。 凝集のばらつきは、標準化されたリコンビナントタンパク質を使用することで最小限に抑えることができます。 バックグラウンドノイズが高い場合は、プレート洗浄手順と試薬の純度を確認してください。
アブカムのELISAキットは研究目的にのみ使用すべきであり、診断目的には使用しないでください。