測定を可能とするため、ほとんどのフローサイトメトリーアッセイでは直接的または間接的にラベルを結合させる必要があります。標識物には、酵素、蛍光色素またはビオチンなどがあります。フローサイトメトリーでは、複数の抗体染色方法があり、どの方法を選ぶかは、利用可能な細胞の種類、抗原、使用する試薬によって異なります。

研究を強化するためのフローサイトメトリーアプリケーションガイドをご覧ください。

フローサイトメトリー・アプリケーションガイド

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直接染色と間接染色

直接法による免疫蛍光染色では、標識物（例：FITC）を直接標識した抗体と細胞を一緒にインキュベートします。直接標識抗体を使用すると、抗体インキュベーションが1ステップのみで済み、二次抗体による非特異的結合の可能性を排除できます。

間接染色では、一次抗体は標識された二次抗体によって検出される。この二次抗体は、一次抗体に特異的な抗体を使用します。あるいはアビジン-ビオチン系を用いることで、一次抗体をビオチンに結合させ、蛍光標識したアビジンで検出することもできます。

直接染色プロトコールと間接染色プロトコールの両方における重要なステップには、フローサイトメトリー抗体の適切な選択、インキュベーション、および洗浄が含まれ、信頼性の高い結果と細胞表面上の特定の抗原の最適な検出を確実にします。抗体が意図した抗原にのみ結合し、個々の細胞の分析に信頼できるデータを提供することを保証するため、抗体のターゲット特異性の検証は、正確で信頼性の高いフローサイトメトリーの結果に不可欠です。

図8. フローサイトメトリーの直接標識および間接標識

抗原検出における直接法と間接法のメリットとデメリット

抗原検出の直接法と間接法には、それぞれメリットとデメリットがあります（表1）。フローサイトメトリーでは、時間を節約でき、使いやすいという理由から、一般的に直接法が好まれます。これらの要素はマルチカラー解析でも重要ですが、二次抗体を用いると、シグナルの増幅が得られます¹。

表1. 抗原検出における直接法と間接法の比較。

要素	直接法	間接法	補足情報
実験時間	短い	長	直接法では標識ステップが1回のみのため、プロトコルは通常、間接法よりも短い。
費用	長	短い	二次抗体を必要とする間接法のほうが、費用はかかるが、二次抗体は、標識済み一次抗体に比べて比較的安価である。さらに、同一の二次抗体により複数の一次抗体を検出可能。
煩雑さ	短い	長	間接法では、二次抗体処理操作を行う分、実験のステップが多くなる。また、適切な二次抗体の選択と追加のコントロールが必要。
柔軟性	中程度	中程度	市販の標識済み一次抗体では、蛍光色素とターゲットの組合せが限定される。ただし、間接法では同時に検出できる抗原数は限られる。
感度	短い	長	複数の二次抗体がそれぞれの一次抗体に結合することで、シグナルが増幅される。
種交差反応性	最小限	種交差反応の可能性あり	二次抗体が、ターゲット以外の種と交差反応する可能性。血清吸着処理済みの二次抗体を用いることで交差反応性を防ぐことができる。
バックグラウンド	低減	バックグラウンドの可能性あり	間接法では、内在性免疫グロブリンを含むサンプルはバックグラウンドが高くなる可能性。

細胞内染色

フローサイトメトリーにおける細胞内抗原の染色プロトコルでは、様々な固定法および透過処理法を用いることで、抗体が細胞内タンパク質にアクセスできるようにします。これらの細胞内タンパク質の検出は、典型的には、蛍光標識された抗体および様々な蛍光色素を使用して達成され、実験設計および多重化における柔軟性を提供します。フローサイトメトリーは、細胞だけでなく小胞などの他の粒子の分析にも使用でき、多様な生物体の研究を可能にします。染色を成功させるには、抗体滴定中の実験条件の最適化、フローサイトメーターを正しくセットアップするための適切なコントロールの使用、固定・透過処理手順の最適化が必要です²。

分泌タンパク質の検出

分泌タンパク質は検出する前に細胞から放出され、急速に分解される可能性があるため、検出は容易ではありません。分泌を妨げる薬剤（ブレフェルジンAなど）を使用してタンパク質をゴルジ体に保持することにより、分泌を妨げることも可能です。その後、細胞内染色法を用いてターゲット・タンパク質を検出できます。

蛍光色素

蛍光色素は、フローサイトメトリーでの検出に不可欠です。フローサイトメトリーには、さまざまな蛍光色素が利用でき、それぞれに異なるスペクトル特性があり、実験設計における多重化と柔軟性を可能にします。蛍光色素の特性を理解することは、マルチカラー実験における蛍光のスピルオーバーを補正するために重要です。レーザラインとチャネルの互換性を分析するには、当社の蛍光蛍光色素放出と励起スペクトルのチャートを参照してください。」蛍光色素は、フローサイトメトリーの蛍光検出試薬として蛍光抗体とともによく使用されています。これらは、一般に吸光度（励起）および発光スペクトルと呼ばれる波長の範囲内の光を吸収および放出する（図 9）3 。

図9. 蛍光色素の励起・蛍光

フローサイトメトリーに用いられるタンデム色素

マルチカラー解析では、2つの異なる蛍光色素が共有結合したタンデム色素が必要になることが多いです。一方の蛍光色素（ドナー）は特定のレーザー波長で励起され、もう一方は異なる波長で光を放出します。例えば、phycoerythrin-Cy7（PE-Cy7）では、PEがドナー蛍光色素、Cy7がアクセプター蛍光色素として働きます。したがって、PE-Cy7はPEの励起特性とCy7の蛍光特性を有します（図10）⁴。

図10. タンデム色素の励起および発光

タンデム色素を使うと、複数の蛍光色素を1つのレーザーで励起することや複数の検出器で測定することが可能になり、パネルのサイズと柔軟性が高まります。例えば、Alexa Fluor® 488、PE、PerCP-Cy5.5およびPE-Cy7は青色のレーザー（488 nm）で励起できますが、緑色、黄色、紫色、赤外線を放出します（図11）。

図11. さまざまなタンデム色素の励起および発光スペクトル

タンデム色素の取扱いに関するヒント

タンデム色素は退色しやすいため、常に遮光してください。
タンデム色素で標識した抗体は、凍結によりドナー蛍光色素が変性する恐れがあるため、凍結しないでください。
サンプルの固定・透過処理は輝度の低下につながるため、最低限にとどめてください。
バッチ間のばらつきが大きいため、各バッチを最適化する必要があります。
FRETの効率は100%ではないため、ドナーからの漏れ込みが生じる可能性があります。
タンデム色素の分解や分離を防ぐため、細胞の標識は4°Cで行ってください。

フローサイトメトリーで使用する蛍光色素の選択

フローサイトメトリーにおいて、陽性集団と陰性集団を分離する能力は、抗体に結合する蛍光色素に依存することが多いです。種、サブクラス、アイソタイプ、および標識などの要因を考慮して、二次抗体および蛍光色素複合体について利用可能なオプションを見直すことが重要です。実験を計画する際は、最適な結果を得るために、特定の実験要件に基づいて適切な蛍光色素標識を選択してください。

表2に、よく使用される蛍光色素の特性の一般的なガイドを示します。なお、蛍光色素の相対輝度は、フローサイトメトリーで使用する抗体によって変わります。

表2． フローサイトメトリーでよく使用される蛍光色素の特性

蛍光色素	励起波長（nm）	蛍光波長（nm）	相対輝度	備考
フィコエリスリン（PE）	565	575	5	タンパク質ベース、非常に輝度が高い
アロフィコシアニン（APC）	645	660	5	タンパク質ベース、非常に輝度が高い
Alexa Fluor 647®	650	668	5	APCと類似だが、低分子で、細胞内染色に適している
PE-Cyanine 7 (PE-Cy7)	496, 565	774	4	タンデム色素、光感受性が高い
PE-Cyanine 5 (PE-Cy5)	496, 565	670	4	タンデム色素、APCとの併用には適さない
Alexa Fluor 488®	495	519	3	FITCと類似だが、安定性と輝度が高い
Alexa Fluor 700®	696	719	2	抗原量が多い場合の標識に有用
FITC	494	520	2	pH変化および退色への感受性が高い
APC-Cy7	650	774	2	タンデム色素、PE-Cy7との併用には適さない
Pacific Blue	410	455	1	抗原量が多い場合の標識に有用