Lightning-Link™キットによる非抗体タンパク質、ペプチド、低分子の標識
Lightning-LinkTM標識システムは、約50のラベルのいずれかとコンジュゲートを作る最も簡単な方法です。 Lightning-LinkTMキットは、IgG抗体の標識用に開発されていますが、幅広い非抗体タンパク質や分子用に最適化できます。 以下のガイドは、抗体以外の分子にラベルを付ける場合に役立ちます。
タンパク質に関する主な考慮事項
リジン残基
最も重要な考慮事項は、タンパク質にリジン残基があるかどうかです。 すべての抗体には複数のリジン残基がありますが、正常なタンパク質についても同じことが想定できません。 リジン残基の数に対する懸念は、タンパク質のサイズが減少するにつれて増加します。 しかし、多くの場合またはほとんどの場合、タンパク質の推定アミノ酸配列が知られ、その配列はリジン残基（KまたはLys、単一文字または3文字のコードが使用されるかどうかによる）について検査することができます。例えば、UniProtからのUniParcは、タンパク質配列について広く使用されているデータベースです。
タンパク質については、反応の効率を予測することはできず、初期の最適化が必要になる場合があります。
Lightning-Link TMバイアルに追加するタンパク質のサイズと量
Lightning-Link® プロトコールでは、キットの最も一般的な使用法であるため、添加する抗体の量を推奨しています。 しかし、量は他のタンパク質に合わせて調整することができます。 標識のモル比は、標識の過剰量がタンパク質を損傷したり、最終アッセイで高いバックグラウンドを引き起こす可能性があるため、必須です。 例えば、標識されるタンパク質が75 kDa（抗体の半分のサイズ）である場合、10 μgのタンパク質の添加は10 μgの抗体と比較して、モル用語で2倍の量を導入するでしょう。 この結果、反応終了時の未標識タンパク質の存在が考えられます。 これが懸念されるかどうかはアッセイの用途によって異なりますが、より少ないタンパク質（この場合5 μg）の添加は、通常、より安全な開始位置になります。
小さなタンパク質（しかし、まだ10 kDa超）
75 kDaのタンパク質に対して推奨される上記のアプローチを考慮すると、タンパク質のサイズがさらに小さくなると、バイアルに添加する量をさらに減少させることは論理的であるように思われます。 しかし、タンパク質が、HRP（40 kDa）、フィコエリスリン（240 kDa）、アルカリホスファターゼ（160 kDa）などの一部の標識よりもかなり小さい場合があり、 タンパク質に標識するのではなく、標識（L）がタンパク質（P）で標識されているとも考えられます。 大きな標識は表面にいくつかの反応基を有している場合があり、小さなタンパク質のいくつかの分子に標識することができます（すなわち標識構造L1Pn、n≥1）。 特定の状況では、これはメリットである可能性があります。したがって、タンパク質が非常に小さいという理由だけで、タンパク質の量をすぐに減らすべきではありません。 別の場合には、L1Pnが必要となることがあり、そのような場合には、モル過剰のPを使用すべきではありません。 Lightning-LinkTMのメリットは、標識反応を小規模（抗体では10 μgなど）で実施できることです。これは、他のタンパク質の条件を最適化するのに最適です。
ペプチド／低分子（10 kDa未満、多くは1 kDa未満）
このような分子では、リジン残基があったとしても、非常に少ないことは避けられません。 しかし、多くのペプチドは、遊離N末端の最初のアミノ酸に第一級アミンを持っており、これがLightning-LinkTM反応に関与できます。 ただし、場合によっては、例えば、in vivo でのでのペプチド安定性を改善するため（例：アミノペプチダーゼによる攻撃を防止するため）、ペプチド合成中に付加されたアセチル基によってN末端が「ブロッキング」されていることがあります。 両N末端がブロッキングされ、リジン残基がないペプチドは、Lightning-LinkTM技術では標識できません。
ペプチド以外の低分子は、第一級アミンを含む場合、Lightning-LinkTMと適合性がある可能性があります。 これらは-NH2基ですが、例えばアミド基、-CO（NH2）基などの一部の官能基では、-NH2部分は隣接基（この場合カルボニル基）によって強く影響を受け、アミド基が非反応性になることに留意してください。一般的に、-NH2基が-CH2基に結合している場合は反応性である可能性があります。 実際に、タンパク質や抗体中にリジン残基がある場合、リジン側鎖は4個の-CH2基が連なった後に末端に-NH2基が結合しています。
低分子または小さなペプチドのいずれにおいても、Lightning-LinkTMバイアルにどれくらいの量を加えるべきかを決定する上で、抗体と比較した分子のサイズが問題になることは特にありません。 HRPなどのタンパク質標識は、ほぼ確実にいくつかの低分子と結合します。多くの場合、この状況は望ましいものですが、低分子をどれくらい添加するかを決定する前に、最終的なアプリケーションを検討する必要があります。 複数の低分子を結合する必要がある場合は、1 mM濃度で分子を追加できます。 これにより、効率的な標識が得られますが、例えば遊離低分子が最終アッセイに干渉すると予想される場合など、結果として生じる標識を脱塩する必要がある場合があります。 あるいは、低分子の濃度を精製の必要がないレベルまで下げるようにすることもできます。 どのような状態が最適であるかを予測できない場合は、さまざまな濃度／量を検討することができます。
最後に、上記の例は抗体以外の多くのシナリオに対応したものですが、標識される分子に特異的な特徴がある場合、またはどのように進めるべきかわからない場合は、こちらに連絡して、さらなるアドバイスを求めてください。
