細胞の生存能力に関するアッセイ

細胞生存とは、簡単に言うと、サンプル中の健康な生細胞の数です²。 コントロールに対する割合として計算した場合、80-95%の細胞生存率で培養細胞が健康であることが示されます。 懸濁培養の場合、トリプシン処理中に死細胞が洗い流されないため、生存率がわずかに低くなる可能性があります。

細胞生存アッセイの概要

細胞生存率の測定には以下のアッセイも使用できます。

• 代謝アッセイ
• 細胞毒性アッセイ
• 細胞増殖および細胞周期アッセイ

これらのアッセイは、セルヘルスの指標と同様、代謝活性、ATP量または細胞増殖に依存します。 細胞膜の完全性の喪失やその他の細胞損傷・細胞死マーカーを使用して、間接的に細胞生存率を測定することができます。

これらのアッセイ法の詳細と当社のアッセイキットについては、以下をご覧ください。

• 細胞生存アッセイ：MTS、レサズリン、TMRE、カルセイン・バイオレット、ATPルミネセンス
• 細胞毒性アッセイ：LDHアッセイ、DRAQ7®、当社の生細胞／死細胞の色素コンビネーション・アッセイ
• 細胞増殖・細胞周期アッセイ：EdU、ヨウ化プロピジウム、CFSE

細胞生存アッセイと細胞毒性アッセイの違い

代謝アッセイ、細胞毒性アッセイ、細胞増殖および細胞周期アッセイはすべて生存率の評価に使用できますが、それぞれ異なる視点を提供します。

細胞生存アッセイでは、代謝、DNA合成、細胞分裂などの正常な細胞機能のマーカーを測定します。これらは生細胞数の測定に使用される一方で、代謝活性や正常な機能のレベルが低下した場合にも反映されるため、細胞毒性の指標としても使用できます。 細胞生存アッセイでは、サンプル中に残存する生細胞数のみが示されますが、この数が細胞毒性や増殖抑制作用の結果であるかどうかは示されません。

対照的に、細胞毒性アッセイでは、膜の完全性の喪失など深刻な細胞損傷のマーカーを検出することにより、細胞に対する化学物質の毒性を測定します。 細胞毒性アッセイでは、間接的に細胞生存を測定することが可能です。

細胞に起こっていることの全体像を把握するには、細胞生存アッセイと細胞毒性アッセイを組み合わせることをおすすめします。

代謝アッセイ

代謝は生物学の中心をなす複雑なプロセスです。 代謝の変化は、がんから神経変性に至るまで、そしてそこに留まらず非常に広範囲の結果に関与しています。

細胞内では、代謝により、エネルギーを産生し、生命を維持する複数の酵素反応がもたらされます。 これらのプロセスの測定は、その目的が将来の実験に関する情報収集なのか、疾患進行の評価なのかを問わず、研究において不可欠です。

代謝アッセイでは、代謝に関与する酵素およびタンパク質の存在を定量化することにより、細胞生存率が示されます。 増殖中の細胞は代謝速度が速くなるため³、代謝アッセイを用いて増殖を評価することも可能です。

代謝アッセイ選択時に考慮すべき要素は以下のとおりです。

• アッセイ感度
• シグナル・ノイズ比
• 扱いやすさ
• 試薬の安定性⁴

一般に、発光に基づくアッセイは、蛍光または吸光度に基づくアッセイよりも感度が高くなります。

また、代謝アッセイは、代謝物や代謝酵素の測定など、生存率の評価以外の目的にも使用されます。 詳細は代謝測定ガイドをご覧ください。

色素還元アッセイ

色素還元アッセイは、大きくテトラゾリウム・アッセイとレサズリン・アッセイに分けられます。 これらのアッセイでは試薬を細胞サンプルとインキュベートして、集団中の生細胞の割合を明らかにします。 試薬中の化合物は代謝活性のある環境において色素を形成します。この色の変化を定量化することで、細胞生存の程度を示すことができます（図1参照）。

図1. 色素還元アッセイの概要

テトラゾリウム・アッセイ

テトラゾリウムによる細胞生存アッセイでは、細胞内の各種脱水素酵素により形成される有色ホルマザンの吸光度を検出します。

最もよく使用されるテトラゾリウム・アッセイは以下の2種類です。

• MTTアッセイ – 正電荷をもつテトラゾリウム塩、細胞内に容易に透過する。
• MTS、XTTおよびWST-1アッセイ – 負の電荷を帯びたテトラゾリウム塩、細胞内に容易に透過しない⁵。

MTTアッセイ

MTTアッセイは、トリチウム標識チミジン取り込みアッセイに代わる非放射性の代替品を提供するために開発されました。 しかし、MTTアッセイでは、細胞生存は測定できても細胞増殖は測定できません。

MTTは、細胞内の基質（NADHおよびNADPHなど）との電子伝達反応を介してホルマザンに変換されます（図2）。 このホルマザン結晶は不溶性で、細胞内および培地内に沈殿物を形成します。 分光光度計で色の変化を検出するには、結晶を溶解する必要があります。 DMSOやSDSなどの溶液を使用してホルマザン結晶を溶解することもできますが、MTTの毒性も考慮すると、MTTアッセイはエンドポイント・アッセイとして使用しなければなりません。 MTTは光感受性もあるため、暗所で保管・使用する必要があります。

メリット：

• シンプル
• 使いやすい
• 汎用性が高い

デメリット：

• 毒性あり
• 化学的干渉を受けやすい
• 蛍光および発光に基づく細胞生存アッセイより感度が低い

図2. 代謝活性のある細胞でのMTTの還元による不溶性ホルマザンの生成

MTS、XTTおよびWST-1アッセイ

MTS、XTTおよびWST-1アッセイでは、培地に溶ける性質の産物が形成されます。 このため可溶化のステップは省略されますが、これらのテトラゾリウム塩は細胞膜を容易に透過しません。 そのため、中間電子受容体試薬が必要になります。 この中間試薬は細胞内に入り、還元されて細胞外に排出された後、その電子をテトラゾリウム塩に移動させることができます。 これにより、テトラゾリウム塩は可溶性ホルマザンに変換されます（図3）。 ただし、中間試薬は細胞に毒性を示す可能性があるため、サンプルやアッセイ条件に応じて、反応を最適化することが重要です。

アッセイの産物は可溶性であるため、同一のプレートを用いて経時的に複数回にわたり測定することが可能ですが、インキュベーションは4時間を超えないようにしてください。 さらに、MTS、XTTおよびWST-1アッセイのバックグラウンドの測定値（0.3）は多くの場合、MTTアッセイの測定値（0.05）よりも高くなります。 ただし、これらの測定値は培地およびpHによって異なります。

メリット：

• 使いやすい
• DMSOによる溶解が不要
• MTTよりも感度および正確性が高い（WST-1が最も感度が高い）

デメリット：

• 中間試薬が必要

• 図3. 中間電子受容体であるフェナジンエトスルファート（PES）によるMTSの可溶性ホルマザンへの還元

メリット：

• 使いやすい
• DMSOによる溶解が不要
• MTTよりも感度および正確性が高い（WST-1が最も感度が高い）

デメリット：

• 中間試薬が必要

レサズリン・アッセイ

レサズリン・アッセイはテトラゾリウム・アッセイと同じ原理に基づいたアッセイで、電子伝達によりある化合物を別の化合物に変換します（図4）。 このアッセイでは、生理的バッファーに溶解されたレサズリンが暗青色の溶液を形成し、これがレゾルフィンに変換されます。

レゾルフィンはピンク色の蛍光産物で、蛍光は吸光度測定よりも概して感度が高いため、このアッセイはテトラゾリウム・アッセイよりもメリットがあります。 さらに、レサズリンには細胞透過性があるため、中間電子受容体を必要とすることなく、シグナル生成が加速される可能性があります。

レサズリン・アッセイは比較的安価であり、他のアッセイと併用することで、細胞毒性のメカニズムに対する理解を深めることも可能です。 このようなメリットはあるものの、他の化合物による蛍光干渉を防ぐために注意が必要です。

他の色素還元アッセイと同様に、長時間のインキュベーションは推奨されず、感度と毒性のバランスを最適化することも必要です。

図4. 生細胞におけるレサズリンからレゾルフィンへの還元

メリット：

• 比較的安価
• テトラゾリウム・アッセイより感度が高い

デメリット：

• 他の化合物による蛍光干渉のリスクがある

図5. イダルビシン（左）またはスタウロスポリン（右）で処理したJurkat細胞のレサズリン・アッセイ（ab129732）を用いた分析

ミトコンドリア膜電位依存的色素

膜電位は、細胞のATP産生能と密接に関連しているため、セルヘルスの指標として使用できます。 ミトコンドリア膜電位依存的にミトコンドリア膜に蓄積する色素を利用して生存細胞を同定することができます。これにはいくつかの色素が利用できます。

膜電位の消失とこれによる色素の消失は、アポトーシス・アッセイにも使用されます。

メリット：

• TMREは可逆的であり、生細胞分析に最適
• JC-1およびJC-10は比較分析に最適

デメリット：

• 固定処理したサンプルに適さないアッセイもある
• パフォーマンスを確保するため、コントロールおよび操作に細心の注意が必要⁶

図6. TMREキット（ab113852）による細胞染色。 A（左）：健康なHeLa細胞。 B（右）：健康なJurkat細胞。

エステラーゼ切断

カルセインなどの疎水性色素は細胞内に拡散し、生細胞内では細胞内エステラーゼにより切断されることで、代謝状態と細胞膜の完全性を示す酵素活性を測定できるようになります。 親水性の蛍光物質を生じ、細胞内に保持されます。

メリット：

• 毒性なし

デメリット：

• 他の化合物による蛍光干渉の可能性

ATPアッセイ

ほとんどのアッセイでは、細胞膜透過化剤を用いてATPを放出させたうえで、ATP依存性ルシフェラーゼによる発光を利用しています。 ATPによるグリセロール（または他の基質）のリン酸化を利用している測定法もあります。

メリット：

• 感度が高い
• 速い

デメリット：

• 細胞の溶解が必要

酸素消費と解糖アッセイ

酸素消費速度は細胞代謝の活性度を反映します。 細胞内酸素レベルや解糖活性を測定することにより、セルヘルスについてより詳細な解析が可能となります。

メリット：

• 非破壊かつ完全に可逆的であり、タイムコース実験や薬剤処理も可能
• アッセイには特殊な装置やプローブは必要はなく、シグナルは標準的な蛍光またはTR-Fプレートリーダーで測定
• 単離したミトコンドリア、培養細胞、組織、酵素調製物、微生物にも使用可能

デメリット：

• インキュベーター内の環境条件を変更しなければならない可能性

図7。HepG2細胞をアンチマイシンAおよびFCCPで処理し、ATP（淡い緑色、ab113849）、
酸素消費（緑色、ab197243）および解糖（濃い緑色、ab197244）に対してアッセイを実施

細胞毒性アッセイ

細胞毒性とは、物質が細胞に対してどの程度の毒性を示すかを測定する指標です。 毒性物質に反応して細胞が増殖を停止するか、アポトーシスまたはネクローシスの結果として細胞死します。

細胞毒性アッセイは、薬物スクリーニングにおいて化合物の細胞毒性作用をスクリーニングするために一般的に用いられています。 化学物質の毒性を判定するため、このアッセイでは深刻な細胞損傷・細胞死のマーカー、通常は細胞膜の損傷を検出します。

細胞膜の損傷を評価する方法には以下のものがあります。

• 細胞外培地に漏出する酵素の活性測定
• 生細胞表面に弱く結合し、死細胞ではより鮮明な染色を生じるアミン反応性色素
• 細胞膜が損傷を受けると、膜不透過性色素が細胞膜を透過し、細胞が染色されることを利用した方法。 メンブレン
• 不透過性色素。 生細胞を染色する色素と一緒に使用し、色素コンビネーションによる生細胞・死細胞アッセイで使用されることが多いです。
• 細胞膜が損傷を受けると、膜不透過性色素が細胞膜を透過し、細胞が染色されることを利用した方法。 生細胞を染色する色素と一緒に使用し、色素コンビネーションによる生細胞・死細胞アッセイで使用されることが多いです。

細胞傷害性薬剤は、細胞膜の損傷を引き起こすことだけでなくタンパク質の合成を停止させ、受容体に不可逆的に結合したり、構造や機能の喪失を引き起こしたりすることにより、細胞に影響を及ぼす可能性があります⁷。

細胞膜の損傷を評価する代替法には、蛍光色素であるスルホローダミンBの結合レベルを生細胞数として用いるSRBアッセイがあります。 クリスタルバイオレット・アッセイも同様です。 いずれの方法も、細胞死における細胞培養プレートからの接着細胞の剥離に依存するため、接着細胞の培養とともに用いる必要があります。

これらのアッセイ法の詳細は以下をご覧ください。LDHアッセイ、DRAQ7®および生細胞：死細胞の色素コンビネーション・アッセイなどのポピュラーな細胞毒性アッセイキットについては以下を参照ください。

酵素の漏出

これらのアッセイでは、細胞膜の損傷により細胞外の培地に漏出した酵素の活性を測定します。 最も一般的なアッセイは乳酸脱水素酵素（LDH）です。

メリット：

• 速い
• 信頼性が高い
• 感度が高い
• 健康な細胞に対して毒性なし
• ハイスループット・アプリケーション用に自動化が可能

デメリット：

• 血清を含む他の化合物による干渉を受けやすい（LDHのみ）

図8. スタウロスポリンまたはシクロヘキシミドで処理したHeLa細胞、未処理細胞、LDH陽性コントロール、および細胞ライセートを用いたLDHアッセイ

膜不透過性色素（色素排除アッセイ）

これらのアッセイでは、細胞膜が損傷を受けると細胞が染色される、膜不透過性蛍光色素（ほとんどがDNA染色色素）が使用されます。 懸濁液中の細胞の細胞膜の完全性を判定するための簡便で広く使用されている方法です⁷。

これまで細胞生存アッセイではヨウ化プロピジウムが一般的に使用されていましたが、その広い発光スペクトルや生細胞への結合性の強さから敬遠され、DRAQ7™や7-AADが広く使われるようになってきました。

メリット：

• シンプル
• 迅速さ
• 細胞数が少ない場合でも使用可能

デメリット：

• トリパンブルーは細胞数を計数する必要があるため、誤差が生じやすい

図9. 細胞死を誘導するためにスタウロスポリンで処理したJurkat細胞で示されるDRAQ7™染色（プロットの上半分）。

生細胞・死細胞アッセイ用のアミン反応性色素

アミン反応性色素は、細胞表面上のアミンと結合することによって生細胞を弱く染色し、細胞膜に損傷を受けた細胞の細胞内アミンと反応することによって死細胞を強く染色します。 死細胞と生細胞は、蛍光強度によって区別します。

メリット：

• 正確である
• 死細胞と生細胞を明確に区別できる
• 固定処理に対応 – イムノフェノタイピングで必要な場合、固定後の分析が可能⁸

デメリット：

• バックグラウンド蛍光が高くなる可能性
• フローサイトメーターが必要

生細胞／死細胞の色素コンビネーション・アッセイ

生細胞と死細胞を区別するため、複数の色素を組み合わせることで、生細胞と死細胞を一度に検出できます。 キットにより細胞の生存を迅速に定量化でき、増殖細胞と非増殖細胞に適している場合が多いです。

メリット：

• 迅速さ
• 他の細胞生存／細胞毒性アッセイよりも頑健かつ正確

デメリット：

• バックグラウンド蛍光が高くなる可能性

図10. 左：生細胞（左上）と死細胞（右下）細胞を用いた生細胞・死細胞アッセイ（ab115347）。 右：ab115347で染色したエトポシド処理細胞。 生細胞は緑色に、死細胞は赤色に染色されています。

細胞増殖および細胞周期アッセイ

増殖とは、細胞数の増加によって、通常は細胞周期（有糸分裂）を通じて細胞が増殖するプロセスを指します。 生物の発生・成長において重要であることに加え、増殖におけるメカニズムの機能不全はがんなどの疾患につながる可能性があります⁹。

細胞生存アッセイでは休止期にある細胞や老化細胞を含むすべての生細胞を測定するのに対し、細胞増殖アッセイでは活発に分裂している細胞数を測定します⁴。 生細胞のみが増殖できるため、細胞増殖アッセイは細胞生存の指標となる可能性があります。 分裂細胞数は、DNA濃度、DNA合成、代謝活性または増殖特異的タンパク質の分析により測定できます。

増殖はがんの予後の指標として使用でき、悪性度の高いがんでは増殖率が高くなります。 このため、増殖アッセイは組織を用いることが多く、Ki67、PCNA（proliferating cell nuclear antigen）、MCM（minichromosome maintenance）¹⁰などのマーカーがよく知られています。増殖のタンパク質マーカーは以下のとおりです。

測定方法：

• 細胞周期を解析するためのDNA染色色素
• 色素希釈アッセイ
• DNA合成中のヌクレオシド・アナログの取り込み

よく使用されるアッセイキット：EdU、ヨウ化プロピジウム、CFSE。

細胞増殖は代謝アッセイを用いて測定することもできます。上記の代謝アッセイについては、本ガイドの該当セクションをご覧ください。

細胞増殖を測定するためのDNA量の使用（細胞周期アッセイ）

DNA染色色素は細胞集団中のDNA含量を測定し、細胞周期の状態を調べる方法で、フローサイトメトリーがよく使用されます。 これらの色素は、DNAと結合すると蛍光を発します。 細胞中に存在するDNA量に比例して結合するため、DNA複製を受け、分裂の準備段階（S期およびG2期）にある細胞は色素を取り込み、より明るく蛍光を発します。 最もよく使用される色素はヨウ化プロピジウムです。

メリット：

• 汎用性が高い
• 分かりやすい

デメリット：

• 色素によっては、細胞を固定または透過処理（ヨウ化プロピジウム、DAPI）する必要があるが、これらは蛍光タンパク質および一部の表面マーカーに適合しない場合が多い

図11. チミジン（B）およびノコダゾール（C）で処理したHeLa細胞をPropidium iodide flow cytometry kit (ab139418)で測定。 ピークは2Nおよび4NのDNA含有量を示します。

DNA合成中のヌクレオシド・アナログの取り込み

細胞増殖を評価するのに最も信頼性が高く正確な方法は、DNA合成を測定することです。 この方法では、生細胞と、DNA合成時にDNAに取り込まれる化合物を一緒にインキュベートします。 次に、これらの化合物をレポーターによって検出します。

チミジン・アナログはDNAへの取り込みに選択される化合物であり、DNA複製中にチミジンに置き換わります。 これにより増殖細胞と娘細胞が標識されます。 ただし、チミジン・アナログは変異やDNAの損傷を引き起こす可能性があり、それゆえ細胞周期に影響を及ぼす可能性があることを認識することが重要です^11,12。

ブロモデオキシウリジン（BrdU）およびエチニルデオキシウリジン（EdU）を用いたアッセイでは、DNA複製中に新たに合成されたDNAにBrdUまたはEdUを取り込ませて、これを検出します。 BrdUは抗体を用いて検出しますが、EdUでは蛍光色素やビオチンで容易に直接標識でき、ストレプトアビジン-HRPを用いて比色法または蛍光法で測定することができます。 制約の厳しいBrdUプロトコールとは異なり、Edu染色では抗体を用いた多重染色も容易です。

この方法は、免疫組織化学染色（IHC）、免疫細胞化学染色（ICC）、ELISA、フローサイトメトリーおよび一部のマルチプレックス・アッセイに適しています。 BrdUでは免疫検出、EdUでは化学的検出が使用されます¹³。

これらのアッセイの詳細については、細胞増殖ガイドをご覧ください。

メリット：

• 正確かつ高い信頼性
• ハイスループット／ロースループットの選択が可能

デメリット：

• プロトコールが長く複雑になる可能性
• DNAの変性により、その後の多重染色ができない（BrdUのみ）

図12. 増殖中のHeLa細胞のEdU染色。 Hoechst 33342 (ab145597)を用いて染色したDNA（青色）。 緑色の細胞はEdU + Hoechst陽性。

色素希釈アッセイ

色素希釈アッセイで使用する色素（または蛍光色素による細胞増殖アッセイ）は、複数世代にわたって細胞内に保持されます。 娘細胞は親細胞の色素の半分を受け取りますが、これをフローサイトメーターで測定します。 最も長く使用され手法が確立されている色素は、CFSE（carboxyfluorescein succinimidyl ester）です。

メリット：

• ホルムアルデヒドおよびアルコール固定後に蛍光を保持
• 多重染色分析が可能

デメリット：

• CFSEは高濃度で細胞毒性あり（適切な濃度では細胞毒性なし）

図13. CFSE（ab113853）希釈アッセイのフローサイトメトリー分析。

増殖のタンパク質マーカー

細胞増殖を調べるもう1つの方法は、増殖細胞に発現しているが非増殖細胞には発現していない特定のタンパク質を調べることです。 増殖中に発現する抗原に対して特異的な一次抗体を使用する必要があります。

これらの抗原は通常、G0期を除くすべての細胞周期にわたって核周辺または核内の領域に発現しており、優れた細胞増殖マーカーとなっています。Ki67は広く使われている増殖マーカーであり、がんの診断・予測マーカーとして日常的に病理検査室で使用されています。 もう1つの一般的なマーカーとしてPCNAもありますが、Ki67の方がさまざまな臓器の腫瘍において、高い感度と特異性で細胞増殖を評価できることが複数の研究で示されています^{14, 15, 16, 17}。 注目されているマーカーとしてMCM-2がありますが、最近の研究から、Ki67およびPCNAよりもがんの予後予測能が高い可能性が示唆されています^{18, 19}。

しかしながら、特に臨床現場では、増殖の「最良の」マーカーとするには矛盾したデータが多いです。

これらのイムノアッセイは、固定した組織サンプルやIHCによる分析に最適です。

メリット：

• 正確かつ高い信頼性
• 裏付けとなるデータが豊富
• 一部の症例では臨床診断・予後予測に有用

デメリット：

• ハイスループットに限界がある
• 結果のスコアリングが主観的である
• 臨床現場では、細胞増殖の「最良の」マーカーとして矛盾したデータが得られている

図14. 成魚ゼブラフィッシュの腸から作製した凍結切片の免疫組織染色。Anti-PCNA antibody [PC10] (ab29)で標識。

図15. マウスの脾臓から作製したホルマリン／PFA固定パラフィン包埋切片の免疫組織染色。anti-Ki67 antibody (ab15580)で標識。

図16. ヒト小細胞肺癌組織から作製したホルマリン／PFA固定パラフィン包埋切片の免疫組織染色。anti-MCM2 antibody (ab4461)で標識。

クローン形成アッセイ

ハイスループットにはほとんど用いられませんが、古典的な細胞増殖アッセイの方法として、クローン原性／クローン形成アッセイを用いる方法があります。 このアッセイでは、細胞を低密度でプレート培養し、形成されたコロニーの数をカウントします。

メリット：

• 干渉のリスクが低い²⁰

デメリット：

• 手動計数によりエラーが生じやすい
• 手間がかかる
• 接着細胞に限定される

老化アッセイ

老化は腫瘍抑制機構であり、加齢の根本原因であると考えられています。 細胞老化とは、細胞が生存しているものの分裂していない、代謝が停止した状態を示します。

老化細胞のマーカーとして最もよく使用されるのは、内在性リソソームβ-ガラクトシダーゼ（SA-β-gal）の過剰発現および蓄積です。 β-gal活性は、比色測定用または蛍光測定用の基質を用いて検出します。

メリット：

• 細胞または組織に最適
• シンプル
• 信頼性が高い

デメリット：

• 細胞の固定が必要（比色法のみ）
• 特定の細胞（破骨細胞とマクロファージ）はβ-gal活性レベルが高く、偽陽性となる可能性あり²¹

増殖細胞のスコアリング

増殖の程度のスコアリングは、臨床現場で特に重要です。 例えば、Ki67陽性細胞の割合は、がんの重症度および経過のスコアリングに使用できます。 増殖タンパク質に関する方法に使用できるスコアリング法はいくつかあり、それぞれにメリットとデメリットがあります。

増殖細胞の測定およびスコアリングに関する詳細は、増殖ガイドをご覧ください。

参考文献