第 2 週:抗体と標識物を選ぶ

実験に適した抗体と標識物を選び出すことは非常に重要です。ここではこれらの選択方法について、いろいろな角度から解説します。蛍光イメージングを成功させるための最大のポイントはここかもしれません。

 

1. 直接法と間接法の比較

二次抗体を使わない方法と使う方法、どのような違いがあるのでしょうか?

比較する


2. 二次抗体を選択する


適切な抗体を選ぶためには、ホスト、アイソタイプ、交差性など、さまざまな情報を知っておく必要があります。

選び方を確認する


さらに詳しく...

吸着処理済み(Pre-adsorbed)二次抗体とは?
F(ab) フラグメント抗体とは?

3. 標識物を選択する


酵素、蛍光、ビオチン…。どの標識物が適しているのでしょうか。

適した標識物を選ぶ



4. 蛍光色素を選択する


蛍光色素は多重染色が容易なことなど、さまざまな利点があります。まずは下のミニ・ビデオ「実験に最適な蛍光色素を選択する」をご覧ください。


蛍光色素チャート:コンプリートガイド

蛍光で多重染色を行うには、波長のピークが離れた色素を選ぶのが鉄則です。蛍光チャートを利用し、ピークを調べてみましょう。

チャートを入手する


Alexa Fluor® について、こちらからご覧ください。



第 2 週はこれで終了です。次週は、蛍光を用いた実験のプロトコールです。



ミニ・ビデオ中の解説文

So there are many fluorochromes available. Each one of those will have it's own unique spectra for absorption and emission.
I've got a couple of examples here for PE and for Cy5.
The excitation wavelength is the signature wavelength at which the molecule is excited. So this is the wavelength at which you shine the laser.
The emission wavelength is the signature wavelength at which that fluorochrome emits a photon. So that's the wavelength at which you will detect.

So how does that work? So if you have a laser to that specific excitation length, it will hit an electron that's in resting state within the fluorochrome.
That electron absorbs the energy from that photon and jumps up to a higher energy level state.
It can't keep up that energy level state and eventually and quite quickly, that electron will loose the energy and drop back down to it's resting state.
In doing that, it releases any excess energy in the form of a photon
And that is fluorescence and that is what you're detecting.




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