蛍光ウエスタン・ブロッティングのヒント
近年、蛍光ウエスタン・ブロッティングに対する興味と期待が高まっています。そこで、このアプリケーションを行うに当たってのヒントをまとめました。正しい二次抗体を選び、プロトコールを最適化して、蛍光ウエスタン・ブロッティングをはじめましょう。
二次抗体の選択
明るく、クリアなバンドを得るために、蛍光ウエスタン・ブロッティングに最適化された二次抗体を使用しましょう。
- 多重解析の場合、それぞれの一次抗体の由来動物種が異なっているか、確認してください。
- 種交差性が最小限に抑えられるよう、血清吸着処理された二次抗体を使用しましょう。
IRDye® 二次抗体は、600種類以上のターゲット・タンパク質に対してテストされた実績があり、蛍光ウエスタン・ブロッティングに最適化されています。
発現量が多いタンパク質 （ハウスキーピング遺伝子産物など） | 励起波長: 679 nm 蛍光波長: 696 nm 700nm チャネル | 希釈倍率: 1 : 5,000 - 1 : 25,000 | |
発現量が少ないタンパク質 （通常、解析したいタンパク質） | 励起波長: 778 nm | 希釈倍率: |
抗体の最適化
- 一次抗体と二次抗体の最適濃度を予めテストして、知っておきましょう。まずはいくつかの希釈濃度でテストして、優れたシグナル-バックグラウンド比が得られる組み合わせを採用しましょう。
- 多重解析を行う前に、それぞれの一次抗体と二次抗体の組み合わせの最適条件を個別に知っておきましょう。
プロトコール中で注意すべきステップ
- メンブレンは自家蛍光を発する可能性があり、高いバックグラウンドの原因となり得ます。この問題を克服するために設計された特殊なメンブレンをご使用ください - Low Fluorescence Western Membrane (PVDF)(ab133411)
- バッファー中の溶解しきれていない粒子（ブロッキング・バッファー中のミルクの粉など）はメンブレンに沈着し、蛍光アーチファクトになる可能性があります。したがって、高品質の試薬を使用し、すべての成分が完全に溶解するのに十分な時間を取り、すべてのバッファーをろ過滅菌することを推奨します。
- 慎重にメンブレンを取り扱い、鈍い鉗子を使用し、蛍光アーチファクトを防ぐために引っかき/しわを避けてください。
- インクは蛍光を発するので、ペンではなく鉛筆でメンブレンにマークしてください。
- ブロモフェノール・ブルーは蛍光を発するので、トランスファー前に、ダイ・フロントをゲルから流出させるか、ダイを含むゲル部分を切断してください。
- インキュベーション中と洗浄の最中は、アルミホイルを利用してメンブレンを光から保護してください。