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二次抗体標識物の選び方

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  • アブカムなら二次抗体も安心です
    • 免疫蛍光染色における、直接法と間接法の比較
      • 二次抗体 ポータル
        • Alexa Fluor® ポータル

          ビオチン標識抗体、HRP、蛍光二次抗体について知り、用途に応じて適切な二次抗体を選択しましょう。

          二次抗体は、酵素、ビオチン、蛍光色素/タンパク質で標識することができます。標識の選択は実験用途に依存し、細胞イメージング、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウエスタンブロットなどで一次抗体を発色、蛍光、化学発光で検出することができます。

          ビオチン化抗体、 HRP 、 Alexa Fluor®蛍光二次抗体など、使用用途に応じて以下の表のような標識二次抗体があります。

          アプリケーション二次抗体標識

          免疫細胞化学, IHC-Fr


          Alexa Fluor®,  DyLight®

          免疫組織化学

          Biotin , HRP or HRP-polymer

          フローサイトメトリーAlexa Fluor®,  FITC
          ウエスタンブロットEnzymes - HRP or AP
          ELISAEnzymes -  HRP  or  biotin
          すべての二次抗体を見る

          ビオチン/ストレプトアビジン

          複数のビオチン分子を二次抗体に結合させることができ、ビオチン化された二次抗体は、低レベルで発現したタンパク質の検出に適したシグナル増幅が可能です。可視化は、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用によって行われ、ストレプトアビジンはHRPや蛍光プローブなどのラベルに結合しています。アッセイでは、ビオチン標識二次抗体を最初に添加し、その後、ストレプトアビジンを順次添加するのが一般的です。

          • すべてのビオチン標識二次抗体をみる
          • ビオチン標識二次抗体によって少ない発現量のタンパク質を免疫組織化学で検出できます(英語)


          蛍光標識二次抗体

          蛍光標識は、細胞イメージング、フローサイトメトリー、凍結試料への免疫組織化学(IHC-Fr)に適した実験手法です。単一の色素が特定の波長で励起され、別の波長の光子を放出し、それが蛍光顕微鏡で検出される仕組みです。蛍光標識二次抗体では、一次抗体と結合できる標識二次抗体の数が増えることで、細胞や組織中での一次抗体のシグナル増幅検出が可能となります。増幅されたこのシグナルは顕微鏡で検出できます。

          Alexa Fluor® 標識抗体の利点をご紹介します


          酵素

          酵素による標識は、可溶性の無色基質が水に不溶性の有色化合物に変換される発色反応によって可視化されます。そのためHRPやAPのような酵素は、ウエスタンブロット、免疫組織化学のようなアプリケーションで一次抗体を発色または化学発光的に検出することができます。


          よく使われる酵素:

          ホースラディッシュ・ぺルオキシターゼ(HRP) は、ジアミノベンジジン(DAB)や化学発光などの発色反応によって可視化されます。HRPは44kDaの糖タンパク質酵素標識であり、アルカリホスファターゼよりも安定です。

          HRP 標識二次抗体

          標準的なHRP二次抗体よりも多くのHRPを結合させたHRPポリマー二次抗体を使用することで、IHCでの発現量の少ないターゲットにも最適なシグナル増幅をすることができます。

          Alkaline phosphatase (AP)は水酸化酵素であり、そのシグナルは発色基質であるp-ニトロフェニルリン酸(pNPP)を介して測定されることが多いです。主にウエスタンブロットで使用されています。

          AP 標識二次抗体
          ​

          蛍光標識二次抗体の使用方法

          蛍光標識二次抗体を選ぶ際のヒント

          • ご使用の機器に合わせて、最も明るい蛍光色素のセットをお選びください。
          • スペクトルのオーバーラップは、適切な蛍光ラベルを選択することで最小化することができます。
          • 最も明るいラベルを、発現レベルが最も低いタンパク質と組み合わせるようにしてください、またその逆も同様です。
          • 二次抗体を使用する際には、二次抗体を介したクロスラベルが発生しないように、すべての一次抗体が異なる種で産生されていることをご確認ください。弊社は同一種内の異なるサブタイプ(マウス IgG1、IgG2、IgG2a、IgG3 など)に対する二次抗体を提供しています。 必ず、対応するサブタイプの一次抗体を使用していなければなりません。
          • 一般的に多色分析の際には、他動物種への交差反応によるバックグラウンドを抑えるために吸着処理済み二次抗体が用いられます。
          • 二次標識体を選択する際には、試料の自家蛍光を考慮しなければならない場合があります。例えば、肝臓切片は赤色チャンネルで自家蛍光を発するため、この組織を染色する際には、赤色チャンネルで発光する標識は避けるべきです。


          吸収・発光スペクトルと吸光係数

          下記の蛍光標識物質の吸収・発光スペクトルと吸光係数を参照して、多色染色の実験計画を構築してみてください。

          標識物質

          最大吸収波長 (nm)

          最大放出波長(nm)

          消衰系数

          Alexa Fluor® 405

          402

          421

          35,000

          Cy2

          489

          506

          150,000

          Alexa Fluor® 488

          495

          519

          73,000

          FITC

          494

          520

          70,000

          Alexa Fluor® 555

          555

          565

          155,000

          Cy3

          550

          570

          150,000

          Phycoerythrin

          488

          575

          1,960,000

          Rhodamine

          544

          576

          80,000

          Cy3.5

          576

          589

          150,000

          Alexa Fluor® 568

          578

          603

          88,000

          PE/Texas Red®

          535

          615

          -

          Texas Red®

          595

          615

          85,000

          Alexa Fluor® 594

          590

          617

          92,000

          APC

          650

          662

          700,000

          Cy5

          643

          667

          250,000

          Alexa Fluor® 647

          650

          668

          270,000

          PE/Cy7

          488

          670

          -

          Cy5.5

          675

          694

          190,000

          PE/Cy5.5

          535

          694

          -

          Alexa Fluor® 680

          679

          702

          183,000

          Alexa Fluor® 750

          749

          775

          290,000

          APC/Cy7

          633

          776

          -

          Alexa Fluor® 790

          784

          814

          260,000


          Alexa Fluor® conjugated antibodyを使用するメリットについてはこちらをご覧ください。


          Alexa Fluor®およびTexas Red®はライフテクノロジーズの登録商標です。Alexa Fluor®蛍光物質には、ライフテクノロジーズ社がアブカム社にライセンスした技術が使用されています。 DyLight®はThermo Fisher Scientific Inc.およびその子会社の登録商標です。

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