二次抗体標識物の選び方
ビオチン標識抗体、HRP、蛍光二次抗体について知り、用途に応じて適切な二次抗体を選択しましょう。
二次抗体は、酵素、ビオチン、蛍光色素/タンパク質で標識することができます。標識の選択は実験用途に依存し、細胞イメージング、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウエスタンブロットなどで一次抗体を発色、蛍光、化学発光で検出することができます。
ビオチン化抗体、 HRP 、 Alexa Fluor®蛍光二次抗体など、使用用途に応じて以下の表のような標識二次抗体があります。
| アプリケーション | 二次抗体標識 |
免疫細胞化学, IHC-Fr | |
免疫組織化学 | |
| フローサイトメトリー | Alexa Fluor®, FITC |
| ウエスタンブロット | Enzymes - HRP or AP |
| ELISA | Enzymes - HRP or biotin |
| すべての二次抗体を見る |
ビオチン/ストレプトアビジン複数のビオチン分子を二次抗体に結合させることができ、ビオチン化された二次抗体は、低レベルで発現したタンパク質の検出に適したシグナル増幅が可能です。可視化は、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用によって行われ、ストレプトアビジンはHRPや蛍光プローブなどのラベルに結合しています。アッセイでは、ビオチン標識二次抗体を最初に添加し、その後、ストレプトアビジンを順次添加するのが一般的です。 蛍光標識二次抗体蛍光標識は、細胞イメージング、フローサイトメトリー、凍結試料への免疫組織化学（ＩＨＣ-Ｆｒ）に適した実験手法です。単一の色素が特定の波長で励起され、別の波長の光子を放出し、それが蛍光顕微鏡で検出される仕組みです。蛍光標識二次抗体では、一次抗体と結合できる標識二次抗体の数が増えることで、細胞や組織中での一次抗体のシグナル増幅検出が可能となります。増幅されたこのシグナルは顕微鏡で検出できます。 酵素酵素による標識は、可溶性の無色基質が水に不溶性の有色化合物に変換される発色反応によって可視化されます。そのためHRPやAPのような酵素は、ウエスタンブロット、免疫組織化学のようなアプリケーションで一次抗体を発色または化学発光的に検出することができます。
ホースラディッシュ・ぺルオキシターゼ(HRP) は、ジアミノベンジジン（DAB）や化学発光などの発色反応によって可視化されます。HRPは44kDaの糖タンパク質酵素標識であり、アルカリホスファターゼよりも安定です。 標準的なHRP二次抗体よりも多くのHRPを結合させたHRPポリマー二次抗体を使用することで、IHCでの発現量の少ないターゲットにも最適なシグナル増幅をすることができます。 Alkaline phosphatase (AP)は水酸化酵素であり、そのシグナルは発色基質であるp-ニトロフェニルリン酸(pNPP)を介して測定されることが多いです。主にウエスタンブロットで使用されています。 蛍光標識二次抗体の使用方法蛍光標識二次抗体を選ぶ際のヒント
吸収・発光スペクトルと吸光係数下記の蛍光標識物質の吸収・発光スペクトルと吸光係数を参照して、多色染色の実験計画を構築してみてください。
Alexa Fluor® conjugated antibodyを使用するメリットについてはこちらをご覧ください。 Alexa Fluor®およびTexas Red®はライフテクノロジーズの登録商標です。Alexa Fluor®蛍光物質には、ライフテクノロジーズ社がアブカム社にライセンスした技術が使用されています。 DyLight®はThermo Fisher Scientific Inc.およびその子会社の登録商標です。 |