ホールマウントサンプルのIHC染色プロトコール
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ホールマウント染色は、小さな組織片（通常は胚）を切片化せずに染色する方法です。
ホールマウント染色は、免疫細胞化学（ICC）や凍結切片の染色と非常によく似ています。凍結切片（パラフィン包埋切片を除く）で使用例がある抗体なら、ホールマウント胚にも適用できる可能性は高いです。
ICCや凍結切片との違いは、染色されるサンプルが通常のスライド上の切片よりもはるかに大きく、厚みがあるということです。したがって、固定剤、ブロッキングバッファー、抗体、洗浄バッファー、透過処理、基質の発色などのインキュベーションは、サンプルの中心部まで浸透できるように、より長く行う必要があります。
これらのインキュベーション時間は、実験に合わせて最適化する必要があります。下記の詳細なプロトコール（英語）をご参考にしてください。
ホールマウント蛍光免疫組織化学プロトコール
ニワトリ、マウス ホールマウント免疫組織化学プロトコール
ショウジョウバエのホールマウント免疫組織化学プロトコール
固定方法
凍結切片のIHC(IHC-Fr)で使用した抗体の固定液は、ホールマウントにも適している場合が多いですが、多くの研究者は4％パラホルムアルデヒド（PFA）を使用しています。
このPFA濃度は非常に低いのですが、ホールマウントのサンプルでは、サンプルの中心部まで浸透させるために、長時間浸す必要があります。そのため、固定剤によって形成されるタンパク質の架橋が、エピトープへのアクセスを阻害する可能性があり、すべての抗体に適しているわけではありません。
通常、ホルマリン固定パラフィン包埋切片のIHC（IHC-P）では、抗原賦活を行うことができます。しかし、胚のサンプルでは、加熱によりサンプルが破壊されてしまうため、抗原賦活を行うことができません。PFA固定がホールマウント組織でうまくいかない場合、抗体がタンパク質の架橋に阻害されている可能性があり、別の固定剤が必要になります。メタノールは、ホールマウントの手法を最適化する際に、固定剤の第二の選択肢としてよく使用されます。
ゼブラフィッシュ胚の固定と調製には、卵膜を確実に透過させるための追加の処理が必要です。
画像の取得
研究者の中には、胚をそのまま観察し、画像を取得する人もいます。マウントする前に、シャーレの中のグリセロールバッファーに浮かべた状態で、胚全体を撮影することができます。十分に小さい場合は、胚全体をグリセロールにマウントしてから、カバーガラスで封入することもできます。この場合、カバーガラスの角にグリスを塗っておくと固定されます。
胚全体を通して染色が明瞭に観察できない場合、（特に後期胚や大きな組織サンプルの場合）、胚をゼラチンに包埋し、切片化することも可能です。
免疫蛍光標識が使用されている場合、共焦点顕微鏡を使えば、染色後に胚を別々のスライドに切り出すことなく、内部をスキャンすることができます。
胚齢を選択する
胚が成長するにつれて、そのまま染色するには大きくなりすぎます。固定剤、抗体、現像液などさまざまな試薬が試料の中心部まで浸透しにくくなります。また、染色された細胞の数が多くなっていくことで鮮明な画像を得ることが非常に困難になります。しかし、大きい胚や胚齢が高い胚の場合、必要に応じて染色前に分割することができます。
推奨胚齢
- ニワトリ胚：6日まで
- マウス胚：12日まで