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下記の各バッファーは、4 ℃ で数週間、分注後 -20 ℃ で約 1 年間保存が可能です。
Nonidet-P40 (NP40) バッファー
150 mM NaCl
1.0% NP-40 (possible to substitute with 0.1% Triton X-100)
50 mM Tris-HCl pH 8.0
Protease Inhibitors
RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay) バッファー
150 mM NaCl
1.0% NP-40 or 0.1% Triton X-100
0.5% sodium deoxycholate
0.1% SDS (sodium dodecyl sulphate)
50 mM Tris-HCl pH 8.0
Protease Inhibitors
Tris-HCl バッファー
20 mM Tris-HCl pH 7.5
Protease Inhibitors
ランニング・バッファーなど
ローディング・バッファー (2X Laemmli サンプル・バッファー)
4% SDS
10% 2-mercaptoethanol
20% glycerol
0.004% bromophenol blue
0.125 M Tris-HCl
pH 6.8 に合わせる。
ランニング・バッファー (Tris-Glycine/SDS)
25 mM Tris base
190 mM glycine
0.1% SDS
必要に応じて pH 8.3 に合わせる。
トランスファー・バッファー (ウェット)
25 mM Tris base
190 mM glycine
20% methanol
必要に応じて pH 8.3 に合わせる。
目的とするタンパク質の分子量が 80 kDa よりも大きい場合、SDS を終濃度 0.1 % になるように加える。
トランスファー・バッファー (セミドライ)
48 mM Tris
39 mM glycine
20% methanol
0.04% SDS
ブロッキング・バッファー
5 % スキムミルクまたは BSA
∗フィルターを通した TBST バッファーに、スキムミルクまたは BSA を加えて調製します。フィルターを通すことで、シグナル検出時にメンブレン上に黒い点が現れるのを防ぐことができます。
∗ データシートやウェブサイトで「ウエスタン・ブロッティングに使用できる」と記載されているアブカムの抗体は、SDS や 2-ME などで還元・変性処理したサンプルに対して使用できることが確認されています。データシートやウェブサイトに「非還元のサンプルでも使用可能」との記載がある場合を除き、サンプルは還元・変性処理を行ってください。
∗ この泳動条件は例です。最適な条件は、目的とするタンパク質の分子量とゲル濃度(アクリルアミド濃度)によって異なります。下記にタンパク質の分子量とそれぞれに適したゲル濃度の一覧を示します。
下記の図の様にスポンジ、ろ紙、ゲルとメンブレンを重ねてセットしてください。
∗ メンブレンはニトロセルロースまたは PVDF を使用してください。PVDF の場合、使用前にまずメタノールに浸し、さらにトランスファー・バッファーに浸してからゲルに重ねてください。転写したメンブレンは、ブロッキングを行う前のポンソーレッド染色で、タンパク質の転写の有無を確認できます。
ウエスタン・ブロッティング プロトコール (Webinar)
ローディング・コントロール抗体
電気泳動がきちんと行われているか、メンブレンへの転写が確実にされているか、といった基本的な操作を確認するため、ローディング・コントロール抗体を併用することをお勧めします。
ローディング・コントロール抗体の使用例
抗体: beta Actin antibody - Loading Control (ab8227) 1/5000 希釈
Lane 1: HeLa 細胞抽出物
Lane 2: 酵母抽出物
Lane 3: マウス脳組織由来抽出物
ウエスタン・ブロッティング関連製品