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*1 「一次抗体の「ホスト」(Host)とは何ですか?」をご参照ください。
*2 「ウエスタン・ブロッティングのコントロール」のページをご参照くだささい。
*3 PMSF(ab141032)や、Protease Inhibitor Cocktail(ab65621)をご使用ください。
*4 細胞分画キットとミトコンドリア分離キットが便利です。
*5 抗体精製キットと抗体濃縮キットをご利用ください。
転写の際にゲルとメンブレンの間に気泡が入っていた、または抗体溶液がメンブレンに均一に広がっていなかった:
気泡は必ず取り除いてください。また抗体溶液の反応は、ローテーターなどで撹拌しながら行ってください。
抗体とブロッキング剤が会合している:
ブロッキング剤をろ過してみてください。
一次抗体、二次抗体、または両方の濃度が高すぎる:
各抗体を希釈して使用してみてください。
抗体が分子量マーカーに反応している:
分子量マーカーのレーンとサンプルのレーンの間を、1 列空けて流してください。
ゲルの選択が適切でない:
バンドの位置が高すぎる場合にはアクリルアミド濃度がより低いゲルを、バンドの位置が低すぎる場合にはアクリルアミド濃度がより高いゲルを、それぞれ使用して下さい。
泳動速度が速すぎる、または泳動時の温度が高すぎる:
バッファーの pH を変える、電圧を変える、コールドルーム中で行うなど、電気泳動の条件を変えてみてください。
ゲルを装置にセットするタイミングが早すぎる、またはアクリルアミドの濃度がレーンごとに異なる:
ゲルの組成を見直してください。サンプル・バッファーへの TEMED の添加、ゲル上部への 0.1% SDS 溶液のアプライなどが効果的な場合があります。
電気泳動では、基本的にはタンパク質はその分子量によって分離されます(小さい分子量のタンパク質ほどゲル中を速く移動します)。しかしながらその分子量が変動する要因がいくつかあるため、また分子量以外にも泳動に影響を与える要因があるため、実際のバンドの位置が予想されたものと異なる場合があります。以下に考えられる要因を示します。
※SDS 処理するとタンパク質の荷電は均一化され、移動度に対する荷電の影響は小さくなります。しかしその影響を完全に除くことはできません。下記「4. サンプルは必ず還元・変性条件下で泳動を行うべきですか?」もご参照ください。
ライセートの場合、1 ウェルに全タンパク質として 20-30 ug が目安です。ただしタンパク質の発現量に合わせて調整してください。精製タンパク質の場合、内在性タンパク質、リコンビナント・タンパク質いずれの場合も、1 ウェルに 10-100 ng が目安です。
リコンビナント・タンパク質の配列が全長ではない場合、その配列に使用抗体の免疫原ペプチドの配列が含まれていない(そのリコンビナント・タンパク質に抗体のエピトープがない)可能性があります。リコンビナント・タンパク質と免疫原、双方の配列をご確認ください。またリコンビナント・タンパク質にタグがついている場合、そのタグが抗原抗体反応を阻害する可能性があります。いずれにせよサンプルとしてリコンビナント・タンパク質を使用する場合には、内在性のタンパク質をポジティブ・コントロールとして同時に泳動してみることをお勧めします。
アブカムは原則として、サンプルを還元剤(β-メルカプトエタノールなど)および変性剤(SDS など)で処理した上でテストを行っています。データシートに特別な記載がない場合には、還元・変性条件下で泳動を行ってください。非還元・非変性条件下でテストを行っている場合には、必ずデータシートにその旨が記載されています。データシートをご確認の上、その条件に従ってください。
ブロッキング剤に影響を受けやすい抗原や抗体もありますので、ブロッキング剤の選定には注意を払う必要があります。望ましいブロッキング剤が分かっている場合には、データシートにその旨が記載されていますので、それに従って下さい。スキムミルクの方がコスト的に有利で、また多種類のタンパク質が含まれることから良い結果が得られることもあります。しかしながら通常、BSA の方がクリアな結果が得られることが多いようです。
データシートで「4 ℃ 一晩」が推奨されている場合には、基本的にはそれに従ってください。ただし他の条件でうまくいくことも十分ありえます。時間的な制約などの理由で条件を変更したい場合には、参考文献やアブカム・ウェブサイトの Abreview を参考にして条件検討を行った上で、変更してください。