サンドイッチ ELISA プロトコール

サンドイッチ ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; 酵素免疫測定法）は捕捉抗体（固相用抗体）と検出抗体の二種類の抗体で、抗原を文字通りサンドイッチして抗原を検出し、定量する系です。この系は直接法や競合法といった他の ELISA 系と比較して感度が高いこと（2～5 倍）、検体から抗原を精製する必要がないことなど多くの利点があるため、ELISA 法としては最も広く用いられており、数多くのキットが市販されています^∗1^∗2。ここでは市販のキットを用いず、自身でサンドイッチ ELISA の系を作成するための標準プロトコールをご紹介します。

抗体の選択

サンドイッチ ELISA 系を作成するに当たっては、反応条件（抗体濃度、温度、時間など）の最適化が難しいのですが、それよりも難しくまた重要なのは、捕捉抗体と検出抗体の組み合わせの選択です。その組み合わせが適切でなければ、反応条件をどのように設定しても良い系はできません。組み合わせの選択に当たっては、抗体が結合する抗原上の部位、「エピトープ」がどのように存在しているか、1 種類のエピトープとのみ結合するモノクローナル抗体を用いるか、複数のエピトープと結合できるポリクローナル抗体を用いるか、といったことを考慮し、検討する必要があります。

モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれも、捕捉抗体と検出抗体の両方に使用できます。一般的に高い感度を得るためにはポリクローナル抗体を、高い特異性を求めるならモノクローナル抗体を、それぞれ選択します。選択に当たっては以下をご参照ください。

• 捕捉抗体にモノクローナル抗体を、検出抗体に別のモノクローナル抗体を、それぞれ用いる場合は、一方の抗体がもう一方の抗体の反応を邪魔しない（エピトープが重ならない、または近くにない）ような組み合わせを選んでください。
• 捕捉抗体と検出抗体の双方に同じモノクローナル抗体を用いる場合は、その抗体のエピトープが抗原上に 2 ヵ所以上存在している必要があります。
• 捕捉抗体と検出抗体の双方にポリクローナル抗体を用いる場合は、エピトープの部位についてモノクローナル抗体ほど厳密に考慮する必要はありません。ただし、サブタイプやファミリー・タンパク質など、ターゲット・タンパク質とアミノ酸配列が類似しているタンパク質が存在する場合には、それらとも交差反応する可能性が高くなりますので、ご注意ください。
• モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を組み合わせてサンドイッチ ELISA 系を作成する場合は、サンプル中の抗原にのみ特異的に結合するモノクローナル抗体を補足抗体に、抗原に強く結合するポリクローナル抗体を検出抗体に、それぞれ用いるのが望ましいとされています。

このように捕捉抗体と検出抗体の組み合わせの選択は慣れていない方には難しいかもしれません。そのためサンドイッチ系を構成することができる捕捉抗体と検出抗体を組み合わせたセット製品が市販されています^∗3。最初はこのような製品をお試しいただくことをお勧めします。

捕捉抗体の固相化

1. ポリ塩化ビニルあるいはポリスチレン製のマイクロタイタープレートの各ウェルに、炭酸/炭酸水素バッファー（pH 9.6）で 1～10 ug/ml に希釈した捕捉抗体溶液を 100 ul 加える。

原則として精製抗体を用いてください。腹水や抗血清といった未精製の抗体を用いると、抗体以外のタンパク質にブロックされて、抗体が固相化されにくくなります。

2. プレートの表面をプラスチック製のシールでカバーし、4 ℃ で一晩インキュベートする。
3. シールをはがして捕捉抗体溶液を取り除き、各ウェルを 200 ul の PBS で 2 回洗浄する。捕捉抗体溶液および PBS を取り除く場合は、シンク上でプレート内の液を投げ捨てるように行う。ウェルに残った液は、プレートをペーパータオルに叩きつけて取り除く。
 

ブロッキングおよびサンプルの添加

4. ブロッキング溶液として 0.5 % BSA / PBS または 5 % スキムミルク / PBS を各ウェルに 200 ul ずつ加える。
5. プレートの表面をプラスチック製のシールでカバーし、室温で 1～2 時間、または 4 ℃ で一晩インキュベートする。
6. 希釈したサンプル溶液あるいはスタンダード溶液を各ウェルに 100 ul 加え、37 ℃ で 90 分反応させる。

適切な標準曲線を得るためには、スタンダード溶液の濃度と幅を、予試験で厳密に最適化する必要があります。そのスタンダードはプレートごとに設定してください。また、サンプル、スタンダード共に、1 条件あたり 2 点ないし 3 点測定を行ってください。

7. 液を取り除き、各ウェルを 200 μl の PBS （場合によっては界面活性剤入り PBS） で 2 回洗浄する。
 

検出抗体の反応

8. ブロッキング溶液などで希釈した検出抗体溶液を各ウェルに 100 ul ずつ加える。
9. プレートの表面をプラスチック製のシールでカバーし、室温で 2 時間反応させる。
10. 液を取り除き、PBS（場合によっては界面活性剤入り PBS）で 4 回洗浄する。
11. 検出抗体として酵素標識抗体を用いている場合は 12 に進む。検出抗体として酵素標識抗体を用いていない場合は、希釈した酵素標識二次抗体溶液を各ウェルに 100 ul ずつ加え、9 と同様に反応させ、10 と同様に洗浄する。酵素標識二次抗体の希釈溶液としてはブロッキング溶液、あるいは酵素標識二次抗体のデータシートが推奨する溶液を用いる。
12. PBS（場合によっては界面活性剤入り PBS）で4回洗浄する。
 

検出

ELISA においては様々な標識酵素が検出に利用されていますが、特に広く用いられているのはホースラデッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）とアルカリ・フォスファターゼ（ALP）です。ペルオキシダーゼは赤血球に、アルカリ・フォスファターゼは肺胞細胞や腸管組織に、それぞれ内在するため、バックグラウンドが高くなる可能性があります。用いるサンプルにおいて問題とならない標識酵素を選択するか、または必要に応じて内在酵素を失活させる処理を行ってください、例として、ペルオキシダーゼに対する0.3%過酸化水素溶液 / メタノール処理、アルカリ・フォスファターゼに対するレバミゾール処理などがあります。

以下に HRP および AP に対応する代表的な基質および発色剤を挙げます。

HRP用の基質・発色剤：HRP の基質は過酸化水素 H2O2 です。過酸化水素の還元と発色剤（水素供与体）の酸化が共役し、その結果として発色剤が発色します。

TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)：最も広く用いられている HRP 用の発色剤です。15～30 分反応させた後、等量の 2 M 硫酸を加えて反応を停止させ、450 nm の吸光度を測定します。

OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride)：TMB よりも感度が高い発色剤です。光に感受性が高いので暗所での保存が必要となります。発色後は 492 nm の吸光度を測定します。

ABTS (2,2'-azino-di-[3-ethyl-benzothiazoline-6 sulfonic acid] diammonium salt)：TMB や OPD と比較して、長い反応時間が必要となります（一晩など）。発色後は緑色で、通常停止液を加えず 416 nm の吸光度を測定します。

ALP 用の基質・発色剤：ALP 用の基質・発色剤として最も広く用いられているのは pNPP（p-Nitrophenyl-phosphate；ニトロフェニルリン酸）です。室温で 15～30 分間反応させた後 0.75 M 水酸化ナトリウム溶液を加えて反応を停止させ、405 nm の吸光度を測定します。

注意：基質・発色剤の中には、発ガン物質である可能性があるなど、有害と見なされるものがあります。手袋をするなど、取扱いには十分注意してくだい。

13. 基質・発色剤溶液を各ウェルに 100 ul（もしくは 50 ul）ずつ加えて反応させます。その際できるだけウェルによる時間差を作らないよう、可能であればマルチチャンネル・ピペットを使用してください。基質・発色剤溶液の種類によっては所定の時間反応後、等量の反応停止液を加えてください。

データの解析

一連の濃度希釈を行ったスタンダードを X 軸に、吸光度を Y 軸にそれぞれプロットし、標準曲線（検量線）を作成します。この標準曲線とサンプルの吸光度の値から、サンプルの濃度を求めてください。

^∗1 ELISA kit / ELIPAIR kit / ELISPOT kit
^∗2 SimpleStep ELISA kit
^∗3 ELISA Set / ELIPAIR kit