パラフィン、凍結、浮遊切片のIHC染色プロトコール

パラフィンと凍結切片

試薬はピペットを使って手作業で添加するか、自動化システムや半自動化システムがある場合はこのプロトコールを適応させることも可能です。

インキュベーションは、非特異的結合や高いバックグラウンド染色の原因となる組織の乾燥を防ぐため、加湿チャンバー内で行ってください。密閉式の蓋がついた浅めのプラスチック製の箱の底に濡れたティッシュペーパーを敷けば、適切なチャンバーとなります。スライドはペーパーから離し、試薬が流れ出ないように水平におきます。

プラスチック製のセロロジカルピペットをインキュベーション・チャンバーに合う長さに切り、容器の底に4 cmほどの間隔をあけて2本ずつ接着剤で貼り付けます。こうすることで、スライドを濡れたティッシュペーパーから離して置くための水平な台ができます。

一次抗体と二次抗体の希釈率は、データシートに記載されている希釈率か、もしくは様々な希釈率を試して決定してください。得られた結果から、適切に希釈率を調整してください。

酵素法では西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（HRP）またはアルカリホスファターゼ（AP）が一般的です。これらの酵素には、多くの色素原（発色基質）が使用されています。

手順

必要に応じて、免疫染色を行う前に抗原賦活化を行ってください。

1. 検出のためにHRP標識抗体を使用する場合、内在性ペルオキシダーゼ活性のブロッキングを行うこともできますが、一次抗体のインキュベーションが終わるまで待つことをおすすめします。
   
   H₂O₂は内在性ペルオキシダーゼ活性を抑制し、バックグラウンド染色を低減させます。再水和後の組織スライドをDABの溶液中でインキュベートすることにより、内在性ペルオキシダーゼの存在有無を確認できます。顕微鏡下で切片に褐色部分がある場合は、ブロッキングのステップを行うことで染色を減らすことができます。
   
   エピトープによっては過酸化水素によって修飾され、抗体と抗原の結合が弱くなるものがあります。この問題を避けるために、一次抗体とのインキュベーションが終わってから切片を過酸化水素で処理してください。過酸化水素は、TBSや水で希釈することが可能です。血液塗抹標本やペルオキシダーゼの多い組織にはメタノールが有効です。メタノールで希釈された過酸化水素は、水溶液中での反応による組織のダメージを軽減させる傾向があります。
   
   その他の組織では、TBSまたは水で希釈してください。メタノール/過酸化水素での処理の後、一部の抗体-抗原ペア（特に細胞表面タンパク質）では結合が弱くなることが観察されています。ペルオキシダーゼのブロッキングはHRP標識抗体の場合のみ有効で、AP または蛍光検出を使用する場合は省略することができます。
2. スライドをTBS + 0.025% Triton X-100で、穏やかに振盪しながら5分間、2回洗浄する。
   
   TBS中の0.025% Triton X-100は表面張力を低下させ、試薬を組織切片全体に容易に行き渡らせます。また、Fcレセプターを溶解し、非特異的結合を低減させるとも考えられています。よりきれいなバックグラウンドを得るために、PBSよりもTBSをおすすめします。
3. 10%正常血清と1%BSAを含むTBSで、室温で2時間ブロッキングする。
   
   二次抗体は組織中の内在性免疫グロブリンと交差反応する可能性があります。二次抗体を作製した動物種の正常血清で組織を前処理することで、この反応を最小限に抑えることができます。
   
   一次抗体の添加前に正常血清で処理することで、Fcレセプターが一次抗体と二次抗体のどちらにも結合することを防ぎます。BSAは、疎水性相互作用による非特異的結合を低減させるために含まれています。
3. スライド上の溶液を数秒間水切りし（水洗いはしない）、ティッシュペーパーで切片の周りを拭く。
4. 1％BSAを含むTBSで希釈した一次抗体を添加する。
   
   一次抗体は、メーカーの推奨する希釈率、あるいはあらかじめ最適化された希釈率で希釈してください。通常、多くの抗体は、0.5～10μg/mLの濃度でIHC-Pに使用されます。
   
   一次抗体は、染色する組織とは異なる動物種で作製する必要があります。例えば、マウスの組織に対して、マウスで作製された一次抗体を使用した場合、抗マウスIgG二次抗体はマウス組織内の全ての内在性IgGと結合し、高いバックグラウンド染色を引き起します。マウス組織へのマウスモノクローナル抗体の使用については、マウス・オン・マウスプロトコールで説明しています。
6.  4℃で一晩インキュベートする。
   
   一晩インキュベートすると、抗体が結合する時間が長くなるため、力価や親和性が低い抗体でも使用することができます。抗体の力価や標的への親和性にかかわらず、組織が飽和に達すると、それ以上結合することはできません。一晩インキュベートすることで、この現象が起こることを確実にします。
6. TBS + 0.025% Tritonで穏やかに振盪しながら5分間、2回洗浄する。
7.  検出にHRP標識抗体を使用する場合は、0.3％H₂O₂を含むTBS中で15分間インキュベートする。
   
   酵素に適した色素原で発色させましょう。色素原は、酵素標識、希望の最終色素産物および封入剤の種類（水溶性か有機溶媒系か）に応じて選択します。
   ​
   ​AEC、Fast Red、INT 等の色素原はアルコールに溶けてしまいます。適切な水溶性封入剤を使用し、脱水・透徹はしないでください。

検出工程

酵素法による検出（HRP または AP 標識二次抗体）の場合

1. 1%BSAを含むTBSで希釈した酵素標識二次抗体をスライドに添加し、室温で1時間インキュベートする。
2. 色素原で10分間、室温で発色させる。
3. 流水（水道水）で5分間洗浄する。
4. 対比染色する（必要な場合）。
   
   対比染色として、ヘマトキシリン（青）、nuclear fast red、methyl green（メチルグリーン）などがよく使われます。蛍光検出の場合、DAPI（青）、propidium iodide/PI（赤）などが使用されます。
   
   
5. 脱水、透徹、封入する。
   
   AEC、Fast Red、INT 等の色素原はアルコールに溶けてしまいます。適切な水溶性封入剤を使用し、脱水・透徹はしないでください。
   
   DAB、New Fuchsin、Vega Red、NBT、TNBT等の色素原で発色させた切片は 、脱水・透徹してください。切片を適切な有機溶媒系の封入剤で封入してください。​
   
   有機溶媒系の封入剤で封入された切片は、水溶性封入剤で封入された切片よりも屈折率が優れています。そのため、有機溶媒系封入剤を使用すると、より鮮明な顕微鏡画像を得ることができます。

蛍光検出用

1. 1％BSAを含むTBSで希釈した蛍光標識二次抗体をスライドに添加する。
2. 室温で1時間インキュベートする。
   
   光退色を防ぐため、これらのステップは暗所で行ってください。
3. TBSで5分間、3回洗浄する。
4. 適合した封入剤でマウントし、カバースリップを付ける。
   
   

免疫染色：浮遊切片

材料と試薬

ペルオキシダーゼ・ブロッキング試薬 (40 mL)

• 20 mL 0.2Mリン酸緩衝液
• 8 mL メタノール
• 80 µL Triton X-100
• 2 mL 過酸化水素水
• ddH2Oで40 mLに調製

ブロッキング液

• 0.1M リン酸緩衝液
• 0.3% Triton
• 1%血清（2次抗体の宿主動物種のもの）​

手順

1. 凍結ミクロトームで30-40 μmの切片を切り出す。切片を0.1Mリン酸緩衝液（PBS）1～2 mLが入ったシャーレまたはマルチウェルプレートに入れる。
2. 切片は4℃で1週間まで保存可能。長期保存する場合は、アジ化ナトリウムを加え、シャーレやマルチウェルプレートをラップで包み、4℃で2ヶ月間まで保存可能。長期間保存すると、切片が封入しづらくなる。
3. ペルオキシダーゼ・ブロッキング試薬で15分間、穏やかに振盪しながらインキュベートし、内在性ペルオキシダーゼを失活させる。
4. 0.1M PBS/0.3% Tritonで洗浄する（15分間×3回）。
5. ブロッキング液の中で切片を穏やかに振盪しながら少なくとも1時間インキュベートする。
6. 0.1M PBS/0.3% Tritonで洗浄（15分×３回）する。
7. 一次抗体を添加し、穏やかに振盪しながら4℃で一晩インキュベートする。
8. 0.1M PBS/0.3% Tritonで洗浄する（15分間×3回）。
9. 二次抗体を添加し、室温で2時間、あるいは4℃で一晩、穏やかに振盪する。
10. 0.1M PBS（Triton なし）で洗浄する（15分間×3回）。
11. 0.1M酢酸緩衝液で1回軽く洗浄し、PBSを除去する。
12. 酢酸緩衝液は新しく調製する必要がある。
13. 切片を DAB 反応液に入れる。顕微鏡でDAB反応を観察する（2～10分）。
14. バックグラウンドが十分高くなったら、0.1M酢酸緩衝液に切片を入れて反応を停止する。
15. 0.1M PBSで洗浄する（15分間×3回）。
16. 切片は封入するまで、2～3日低温室で保存可能。
17. 切片をドラフト内で風乾する。切片をhistoclearでインキュベートする（10分間×2回）。
18. もう一度（3回目）histoclearで10分間インキュベートし、封入をおこなう。

19. Ralmountを使用して封入する。蛍光標識された切片には適切な封入剤を使用する。

​シグナルの増幅

より強いシグナルを得るために、酵素や蛍光色素を標的により多く付加させる様々な手法が開発されています。

アビジン-ビオチン複合体(ABC)

カルボキシル化反応における酵素の補因子であるビオチンに対するアビジンの高い親和性を利用した手法です。アビジンはビオチンに対して4つの結合部位を持ち、結合は基本的に不可逆的です。

簡単に説明すると、一次抗体を標的タンパク質に結合させます。次に、ビオチン標識された二次抗体を一次抗体に結合させます。この反応とは別に、アビジンとビオチン標識された酵素の複合体を形成させます。この時、アビジン上の結合部位の一部が未結合のままで残るような比率で混合します。アビジン-ビオチン標識酵素複合体を二次抗体のインキュベーションが終わった組織切片とインキュベートさせます。複合体上の未結合のビオチン結合部位が、ビオチン標識二次抗体に結合し、酵素標識二次抗体や一次抗体を用いた場合よりも、より多くの酵素を標的に付加させることができます。

アビジン-ビオチン複合体の構成成分はキットとして市販されており、この複合体は当社のビオチン標識抗体と使用することができます。組織中に内在性のビオチンが存在すると、アビジン-ビオチン複合体に結合し、バックグラウンド染色を高くしてしまうおそれがあります。このような組織には、腎臓、肝臓、脳、前立腺、結腸、腸、精巣などがあります。

標識ストレプトアビジンビオチン（LSAB）

この方法はABCに類似しており、ストレプトアビジン（アビジン同様の結合親和性）とビオチンの相互作用を利用しています。一次抗体の後にビオチン標識した抗lg二次抗体を添加し、その後、酵素や蛍光色素を結合させたストレプトアビジンを加えます。ストレプトアビジンは（アビジンとは異なり）糖鎖修飾されていないため、レクチンやその他の糖鎖結合タンパク質と相互作用せず、アビジンよりも非特異的なバックグラウンド染色を低く抑えることができます。ABCと比べ、LSABは4-8倍の高い感度を示しました（Giorno R (1984), Diagn Immunol. 2:161-6)。 LSAB ABCキットをご参照ください。

HRPポリマー

最近ではアビジン-ビオチン法（ABC法、LSAB法）よりもポリマー-酵素複合体を二次抗体（例えば、抗マウスやウサギIgG）に結合させた新しいポリマー-酵素-抗体製品が使われるようになってきました。これは、内在性ビオチンの問題が回避できるためでもあります。

​IHC用のマイクロポリマー検出キットは、小さなリンカーを主体とした検出モジュールを使用しており、従来のポリマー主体の検出法で使用されていた大きな複合体よりも組織への浸透性が優れており、その結果、より高感度な検出が可能です。

チラミドシグナル増幅（TSE)

最も効果的な増幅法のひとつが、特許・ライセンス取得済みのTSE（TSAまたはCSAとも呼ばれる）です。他のシステムでは検出が困難だった低量抗原の検出や、性能の悪い抗体で得られた結果の改善に役立ちます。

この方法は、一次抗体とHRP標識二次抗体を添加した後、ペルオキシダーゼ触媒反応により、チラミン-タンパク質コンジュゲート（結合体）のチラミド部分を標的タンパク質周辺に共有結合させます。チラミド結合は共有結合であるため、たとえ抗体の除去処理を行っても、共有結合で付加されたタンパク質は洗い落されることはありません。酵素、または蛍光色素で標識された抗体がチラミン-タンパク質結合体のタンパク質部分を標的とすることによって、シグナルを得ることができます。

プロトコールは、アブカムのラボで当社の試薬や製品を使用した実験に基づいて「ありのまま」で提供しています。これらの条件以外でプロトコールを使用すると、結果は異なる場合があります。

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