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試薬はピペットを使って手作業で添加するか、自動化システムや半自動化システムがある場合はこのプロトコールを適応させることも可能です。
インキュベーションは、非特異的結合や高いバックグラウンド染色の原因となる組織の乾燥を防ぐため、加湿チャンバー内で行ってください。密閉式の蓋がついた浅めのプラスチック製の箱の底に濡れたティッシュペーパーを敷けば、適切なチャンバーとなります。スライドはペーパーから離し、試薬が流れ出ないように水平におきます。
プラスチック製のセロロジカルピペットをインキュベーション・チャンバーに合う長さに切り、容器の底に4 cmほどの間隔をあけて2本ずつ接着剤で貼り付けます。こうすることで、スライドを濡れたティッシュペーパーから離して置くための水平な台ができます。
一次抗体と二次抗体の希釈率は、データシートに記載されている希釈率か、もしくは様々な希釈率を試して決定してください。得られた結果から、適切に希釈率を調整してください。
酵素法では西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ(HRP)またはアルカリホスファターゼ(AP)が一般的です。これらの酵素には、多くの色素原(発色基質)が使用されています。
手順
必要に応じて、免疫染色を行う前に抗原賦活化を行ってください。
検出工程
酵素法による検出(HRP または AP 標識二次抗体)の場合
蛍光検出用
材料と試薬
ペルオキシダーゼ・ブロッキング試薬 (40 mL)
ブロッキング液
手順
Ralmountを使用して封入する。蛍光標識された切片には適切な封入剤を使用する。
より強いシグナルを得るために、酵素や蛍光色素を標的により多く付加させる様々な手法が開発されています。
アビジン-ビオチン複合体(ABC)
カルボキシル化反応における酵素の補因子であるビオチンに対するアビジンの高い親和性を利用した手法です。アビジンはビオチンに対して4つの結合部位を持ち、結合は基本的に不可逆的です。
簡単に説明すると、一次抗体を標的タンパク質に結合させます。次に、ビオチン標識された二次抗体を一次抗体に結合させます。この反応とは別に、アビジンとビオチン標識された酵素の複合体を形成させます。この時、アビジン上の結合部位の一部が未結合のままで残るような比率で混合します。アビジン-ビオチン標識酵素複合体を二次抗体のインキュベーションが終わった組織切片とインキュベートさせます。複合体上の未結合のビオチン結合部位が、ビオチン標識二次抗体に結合し、酵素標識二次抗体や一次抗体を用いた場合よりも、より多くの酵素を標的に付加させることができます。
アビジン-ビオチン複合体の構成成分はキットとして市販されており、この複合体は当社のビオチン標識抗体と使用することができます。組織中に内在性のビオチンが存在すると、アビジン-ビオチン複合体に結合し、バックグラウンド染色を高くしてしまうおそれがあります。このような組織には、腎臓、肝臓、脳、前立腺、結腸、腸、精巣などがあります。
標識ストレプトアビジンビオチン(LSAB)
この方法はABCに類似しており、ストレプトアビジン(アビジン同様の結合親和性)とビオチンの相互作用を利用しています。一次抗体の後にビオチン標識した抗lg二次抗体を添加し、その後、酵素や蛍光色素を結合させたストレプトアビジンを加えます。ストレプトアビジンは(アビジンとは異なり)糖鎖修飾されていないため、レクチンやその他の糖鎖結合タンパク質と相互作用せず、アビジンよりも非特異的なバックグラウンド染色を低く抑えることができます。ABCと比べ、LSABは4-8倍の高い感度を示しました(Giorno R (1984), Diagn Immunol. 2:161-6)。 LSAB ABCキットをご参照ください。
HRPポリマー
最近ではアビジン-ビオチン法(ABC法、LSAB法)よりもポリマー-酵素複合体を二次抗体(例えば、抗マウスやウサギIgG)に結合させた新しいポリマー-酵素-抗体製品が使われるようになってきました。これは、内在性ビオチンの問題が回避できるためでもあります。
IHC用のマイクロポリマー検出キットは、小さなリンカーを主体とした検出モジュールを使用しており、従来のポリマー主体の検出法で使用されていた大きな複合体よりも組織への浸透性が優れており、その結果、より高感度な検出が可能です。
チラミドシグナル増幅(TSE)
最も効果的な増幅法のひとつが、特許・ライセンス取得済みのTSE(TSAまたはCSAとも呼ばれる)です。他のシステムでは検出が困難だった低量抗原の検出や、性能の悪い抗体で得られた結果の改善に役立ちます。
この方法は、一次抗体とHRP標識二次抗体を添加した後、ペルオキシダーゼ触媒反応により、チラミン-タンパク質コンジュゲート(結合体)のチラミド部分を標的タンパク質周辺に共有結合させます。チラミド結合は共有結合であるため、たとえ抗体の除去処理を行っても、共有結合で付加されたタンパク質は洗い落されることはありません。酵素、または蛍光色素で標識された抗体がチラミン-タンパク質結合体のタンパク質部分を標的とすることによって、シグナルを得ることができます。
プロトコールは、アブカムのラボで当社の試薬や製品を使用した実験に基づいて「ありのまま」で提供しています。これらの条件以外でプロトコールを使用すると、結果は異なる場合があります。
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