IHC抗原賦活化プロトコール
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熱処理法（熱誘導抗原賦活法：HIER）と酵素処理法という2つの抗原賦活法についてご紹介します。
ホルマリン固定された組織の多くは、免疫組織化学染色を行う前に抗原賦活化の工程を必要とします。固定時に形成されるメチレン架橋はタンパク質を架橋し、抗原部位がマスキングされます。抗原賦活法は、このメチレン架橋を切断し、抗原部位を露出させ、抗体の結合を可能にします。抗原賦活法には、熱誘導抗原賦活法(HIER: heat-induced epitope retrieval）と酵素賦活法があります。
酵素賦活法は、時に切片の形態を損なうことがあるので、濃度や処理時間の検討が必要です。
熱誘導抗原賦活法は、圧力鍋、電子レンジ、野菜蒸し器などを用いて行うのが一般的です。また、60℃に設定したウォーターバスで、スライドを賦活化液 中で一晩インキュベートする研究室もあります。これは、特に骨、軟骨、皮膚など、高温で加熱するとスライドから落ちてしまう組織切片を扱う場合に有効です。
抗体のデータシートに抗原の賦活法が記載されていない限り、各抗原に最適な方法を実験的に見出す必要があります。これは、熱処理の賦活化に使用するバッファーの選択にも当てはまります。いくつかの方法を試して、最適な染色ができる賦活法を見つけることをおすすめします。
確実な結果を得るための便利なバッファー
熱処理による抗原賦活化で確実な結果を得るためには、アブカムの調製済み抗原賦活化用バッファーをおすすめします。 クエン酸バッファーキット、Tris-EDTAバッファーキット、EDTAバッファーキット、またはTrisバッファーキットからお選びください。
また、Universal 熱処理抗原賦活化試薬キット（当社の代表的なPD-L1クローン28-8で使用）は、ほとんどの抗体と適合性があり、複数のバッファーを必要としません。
酵素を用いた抗原賦活化には、トリプシン溶液キットをお勧めします。また、ペプシン溶液キット、プロテイナーゼ K 溶液キットもご用意しております。
その他、お客様ご自身でバッファーや溶液を調製していただき、下記の推奨方法と同じ方法で行うことも可能です。
熱誘導抗原賦活化用バッファー
以下の3 種類の溶液は、HIER 用バッファーの中で最も一般的なものです。データシートの情報がない場合、賦活化用バッファーの選択は試行錯誤が必要です。
クエン酸ナトリウムバッファー (10 mM クエン酸ナトリウム, 0.05% Tween 20, pH 6.0)
- クエン酸三ナトリウム（二水和物） 2.94 g
- 蒸留水 1 L
- 攪拌して溶解させる。1N HClでpHを6.0に調整する。
- Tween 20 を0.5ml加え、よく攪拌する。室温で３か月間保存可能。
- 長期保存の場合は4℃で保存。
1 mM EDTA, pH 8.0
- EDTA 0.37 g
- 蒸留水 1 L
- NaOHでpH8.0に調整する。
- 室温で3か月間保存可能
Tris-EDTAバッファー（10 mM Tris塩基、1 mM EDTA溶液、0.05% Tween 20、pH 9.0)
- Tris 1.21 g
- EDTA 0.37 g
- 蒸留水 1 L
- 攪拌して溶解させる。pHを9.0に調整する。
- 0.5 mLのTween 20を加え、よく攪拌する。室温で3か月間保存可能。長期保存の場合は4℃で保存してください。
熱誘導抗原賦活法：圧力鍋
この方法では、スライドを金属製のラックに設置する必要があります。
材料と試薬
- 家庭用ステンレス製圧力鍋
- ホットプレート
- 容量が約400～500mLのスライドラック付き容器
- 抗原賦活化用バッファー（Tris/EDTA pH9.0、クエン酸ナトリウム pH6.0、その他）。
手順
免疫組織化学染色を行う前に、同じ組織切片のスライドを1、2、3、4、5分と賦活化し、賦活化時間を最適化するための対照実験を推奨します。
- 圧力鍋に適切な抗原賦活化用バッファーを加える。圧力鍋をホットプレート上に置き、最大出力で加熱する。この時、圧力鍋の蓋は固定せず、上に載せたままにしておく。圧力鍋が沸騰するのを待つ間に、切片の脱パラフィン処理および再水和を行う。
- 沸騰したら、スライドを水道水から圧力鍋に移す。
高温溶液の取り扱いに注意し、ピンセットを使用する。 - 圧力鍋の蓋を製造元の説明書通りに固定する。
- 圧力鍋が完全に加圧されてから、3分間計測する。
- 3分後、ホットプレートのスイッチを切り、圧力鍋を空の流し台に置く。
- 圧力開放弁を作動させ、圧力鍋に冷水をかける。圧力が抜けたら、蓋を開け、10分間冷水を鍋の中に流す。
これは、スライドを十分に冷却して取り扱えるようにするためと、高温にさらされた抗原部位を再形成させるためです。
高温溶液の取り扱いには十分注意してください。 - 続けて免疫組織化学染色のプロトコールを行う。
熱誘導抗原賦活法：電子レンジ
家庭用電子レンジの使用はおすすめしません。加熱のムラが生じ、抗原の賦活化が不均一になってしまいます。加圧環境がないため、抗原の賦活化時間は通常長くなり、ほとんどの場合、切片の剥離を引き起こします。科学用電子レンジがより適切です。ほとんどのメーカーが加圧容器を搭載しており、温度を98℃に一定に保つことができるため、切片の剥離を防ぐことができます。
この方法の場合、バッファーが沸騰して吹きこぼれる可能性があり、賦活化用バッファーが大量に蒸発します。スライド容器のバッファー量に注意し、必要に応じてバッファーを追加してください。また、スライドを乾燥させないようにしてください。
この手順では、スライドはプラスチック製のラックと容器に入れる必要があります。標準的なガラス製の染色ラックと容器は、加熱すると割れることがあります。
材料と試薬
- 科学用電子レンジまたは家庭用電子レンジ (850 W)
- 容量が約400～500mLのスライドラック付き電子レンジ用容器またはコプリンジャー
- 抗原賦活化用バッファー（例：Tris/EDTA pH 9.0、クエン酸ナトリウム pH 6.0 など)
手順
- 切片を脱パラフィン処理し、再水和する。
抗原賦活化液はスライドが数センチ以上隠れる十分な量を使用してください。 - 電子レンジ用容器に適切な抗原賦活化用バッファーを加える。
煮沸中に蒸発することを考慮して、密閉されていない容器を使用してください。蒸発の様子を見ながら、途中で吹きこぼれないように注意し、スライドを乾燥させないようにしてください。 - 電子レンジ用容器にスライドを入れる。容器を電子レンジの中に入れる。家庭用電子レンジの場合、最大出力に設定し、溶液が沸騰するまで待つ。この時点から20分間沸騰させる。科学用電子レンジを使用する場合は、温度が98℃に達したら、20分間抗原が賦活化されるように設定する。
煮沸中に蒸発することを考慮して、密閉されていない容器を使用してください。蒸発の様子を見ながら、途中で吹きこぼれないように注意し、スライドを乾燥させないようにしてください。 - 20分経過したら、容器を取り出し、冷たい水道水を10分間流す。高温の溶液には注意する。
これにより、スライドが十分に冷えて取り扱えるようになり、高温にさらされた抗原部位を再形成することができます。 - 続けて免疫組織化学染色のプロトコールを行う。
熱誘導抗原賦活法：野菜蒸し器
多くの研究室では、熱処理抗原賦活法に野菜用蒸し器や炊飯器を使用しています。この方法は、バッファーの温度を100℃に保つという点で、電子レンジに似ていますが、電子レンジ法のような激しい沸騰はありません。この方法は、蒸し器の代わりに100℃に設定したウォーターバスでも適用できます。
スライドは、プラスチック製または金属製のラックと容器に入れる必要があります。標準的なガラス製の染色ラックや容器は、加熱すると割れるおそれがあります。
材料と試薬
- 野菜蒸し器
- 容量が約400～500mLのスライドラック付き容器（Tissue-Tek社製容器を使用する場合は250mL）
- 抗原賦活化用バッファー（例：Tris/EDTA pH 9.0、クエン酸ナトリウム pH 6.0など)
手順
- 上記と同様、切片を脱パラフィン処理し、再水和する。
- 野菜蒸し器をメーカーの説明書に従ってセットし、予熱する。
煮沸中に蒸発することを考慮して、密閉されていない容器を使用してください。蒸発の様子を見ながら、途中で吹きこぼれないように注意し、スライドを乾燥させないようにしてください。 - 適切な抗原賦活化用バッファーをフラスコに入れて予熱し、沸騰させる。
- スライドラックを入れる容器を野菜蒸し器に入れる。
- 温めたバッファーを容器に注意深く入れ、次にスライドを入れる。簡便に容器を蒸し器に入れる前にバッファーを入れてもよい。
- 蒸し器の蓋を閉める。バッファーを入れた容器にも蓋をしておく。スライドラックを入れると、最初は抗原賦活化液の温度が下がるが、数分で95～100℃に戻る。
- この時点から20分間、容器を蒸し器に入れたままにしておく。
- 20 分経過したら、容器を取り出し、冷たい水道水を 10 分間流し込む。高温の溶液には注意する。
煮沸中に蒸発することを考慮して、密閉されていない容器を使用してください。蒸発の様子を見ながら、途中で吹きこぼれないように注意し、スライドを乾燥させないようにしてください。 - 続けて免疫組織化学染色のプロトコールを行う。
酵素抗原賦活法
使用する酵素は、抗体のデータシートに記載されています。記載がない場合、トリプシンはホルマリン/PFA固定後に抗原賦活化する必要がある様々な抗原に有用です。
組織を酵素溶液で処理する方法には、少なくとも2つの方法があります：スライド上の組織に溶液を直接ピペッティングする方法と、ラックに設置した組織のスライドを酵素溶液が入った容器に入れる方法があります。前者は試薬の使用量が少なく済みますが、スライドを個別に処理する必要があるため、すべてのスライドが同じ処理を受けるように、インキュベーションの時間をスライドごとに注意する必要があります。このため、大量のスライドを酵素液の入った容器に浸して処理する方が簡単です。自動染色システム（例：Ventana）を使用する場合は、適切な酵素賦活化プロトコールをメーカーに問い合わせて下さい。
ピペッティング法：材料と試薬
- 37℃のインキュベーター
- 加湿チャンバー（加湿機能付きインキュベーター、もしくは濡れたペーパータオルが入った容器、のいずれか）
- スライドラック、スライドラック用容器
- 酵素抗原賦活化液（トリプシンの場合は下記参照）
トリプシン・ストック溶液（蒸留水中0.5%）
- トリプシン 50 mg
- 蒸留水 10 mL
- 溶解後、-20℃で保存
塩化カルシウム・ストック溶液 (1%)
- 塩化カルシウム 0.1 g
- 蒸留水 10 mL
- よく攪拌し、4℃で保存
トリプシン溶液 (0.05%)
- トリプシン・ストック溶液(0.5%) 1 mL
- 塩化カルシウム・ストック溶液 (1％) 1 mL
- 蒸留水 8 mL
- 1N NaOHでpHを7.8に調整し、4℃で1か月、もしくは-20℃で長期保存
ピペッティング法：手順
- トリプシン溶液を調製し、37℃に予熱しておく。組織切片の周囲の余分な水分を丁寧にブロッティングしながら除去し、酵素溶液（通常50～100μLで十分）をピペットで切片に添加する。このとき、ピペットチップで切片の周りに溶液を広げる必要がある場合、組織を傷つけないように注意しながら行う。
- スライドを加湿容器に入れ、37℃のインキュベーターに入れる。この時、染色強度に影響する温度のムラができないようにスライドをインキュベーターの棚に直接置かないようにする。スライドを入れる容器は、インキュベーター内であらかじめ予熱しておくとよい。
- 10～20分後（最適化が必要）、インキュベーターからスライドを取り出し、水道水入りの容器に入ったラックに移す。水道水を3分間流し、すすぐ。
- 続けて、免疫組織化学染色プロトコールを行う。
液浸法：材料と試薬
- 37℃のウォーターバス
- スライドラック、スライドラック用の容器
- 酵素抗原賦活化液（トリプシンの場合は酵素賦活ピペッティング法を参照）
液浸法：手順
酵素によっては、活性のために特定のバッファーや補酵素を必要とするものがあるので、選択する酵素の製造元の文献を必ずお読みください。
- ウォーターバスを使用する酵素の最適温度に設定する。スライドラック用の容器2つに超純水を入れる。容器をウォーターバスに入れ、温める。
水またはバッファーでスライドが浸されるように十分な量を使用する。 - 上記と同様に、切片を脱パラフィン処理し、再水和する。スライドを水が入った片方の容器に入れ、温める。
冷たいスライドを酵素溶液に入れると、溶液の温度が下がり、酵素活性が低下して、抗原部位の賦活化が不十分となります。 - もう一つの容器の温水から酵素抗原賦活化液を調製し、容器をウォーターバスに戻して溶液を再加熱する。
酵素の活性を損なわないよう、できるだけ早く酵素抗原賦活化液を調製します。この溶液の温度が戻ってから、スライドを浸します。 - 温めたスライドを酵素溶液に移し、断続的に穏やかに振盪しながら10～20分後、スライドを取り出し、水道水の流水中で3分間酵素を洗い流す。
免疫組織化学染色を行う前に、組織切片を酵素溶液中で10、15、20、25、30分間インキュベートし、賦活化時間の最適化を行ってください。 - 続けて免疫組織化学染色のプロトコールを行う。
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