ゼラチン・ザイモグラフィー・プロトコール
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ゼラチン・ザイモグラフィー Gelatin zymography による、培養上清サンプル中の MMP 活性の検出プロトコールです。
ゼラチン・ザイモグラフィーは、電気泳動で分離したサンプル中の MMP-9 （Matrix metalloproteinase-9、マトリックス・メタロプロテアーゼ 9）および MMP-2 のゼラチナーゼ活性を検出する方法です。基質であるゼラチンを含むポリアクリルアミド・ゲルは、クマシー・ブルー染色するとゲル全体が青く染まりますが、ゼラチナーゼ活性がある MMP-9 または MMP-2 が存在する部位のゼラチンは分解され、透明のバンドとして見えるようになります。
これは細胞培養上清をサンプルとして用いた場合の標準プロトコールです。細胞の種類によって個別に条件設定が必要な場合があります。
培養上清サンプルの準備
- 細胞を 6 ウェルプレート（2 mL/ウェル）または 75 cm2 フラスコ（10 mL）にて、FBS 入り培地で培養する。
- 70～80 % コンフルエント状態になったら、培地を取り除き、FBS フリー培地で細胞を2回洗浄した後、そのまま FBS フリー培地で培養を続ける。
FBS フリー培地での培養時間は細胞株ごとで条件検討が必要。例えば 231G や 468 などの乳癌細胞は、培養上清を回収するまでに 40～44 時間かかる。 - 培養上清を回収し、遠心分離またはフィルター処理により死細胞を取り除く。
- 培養上清を 10 倍濃縮する。
ゼラチン・ザイモグラフィー
電気泳動
- 各レーンのサンプルが同じタンパク質濃度になるように培養上清を希釈する。
サンプルのタンパク質濃度の目安は 5 µg/mL または 15 µg/mL。 - 各サンプルに5X 非還元サンプル・バッファーを加える。
ゼラチンを含む 7.5 % ポリアクリルアミド・ゲル（厚さ 1 mm）を用意する。ゲルの組成は下のテーブルを参照。
各ウェルにサンプルをロードする（1 レーン当たり 10 μL 程度）。1 レーン分は分子量マーカー用に確保すること。
- 適切に分離されるまで 150 V で泳動する。
分離ゲル（7.5 % アクリルアミド） | 濃縮ゲル | ||
1.5 M Tris pH 8.8 | 2 mL | 0.5 M Tris pH 6.8 | 1.25 mL |
30 ％ アクリルアミド | 2 mL | 30 ％ アクリルアミド | 0.67 mL |
H2O | 2 mL | H2O | 3.08 mL |
4 mg/mL ゼラチン | 2 mL | 10 % SDS | 50 μL |
10 % SDS | 80 μL | 10 % APS | 50 μL |
10 % APS | 80 μL | TEMED | 10 μL |
TEMED | 10 μL | ||
ゲルの洗浄と染色
- ゲルを洗浄バッファーで室温にて、攪拌しながら 30 分間 2 回洗浄し、SDS を除く。
- ゲルをインキュベーション・バッファーに移し、37 ℃ で攪拌しながら 5～10 分間リンスする。
- 新しいインキュベーション・バッファーに移し替え、37 ℃ で 24 時間インキュベーションする。
このインキュベーション・バッファーにはゼラチナーゼ活性を引き出すための補助因子が含まれる。 - ゲルを染色液中に浸し、攪拌しながら室温で 30 分 ～ 1 時間染色する。その後、余分な染色液を取り除くため H2O でリンスする。
- バンドがはっきり見えてくるまで、脱色液でインキュベーションする。
酵素活性がある場所は、青いバックグラウンドに透明なバンドとして認められる。
バッファー類の調製
5X 非還元サンプル・バッファー（pH 6.8）
終濃度 | 全量 250 mL |
4 % SDS | 10 g |
20 % グリセロール | 100 ％ グリセロールを 50 mL |
0.01 % ブロモフェノール・ブルー | 0.025 g |
125 mM Tris-HCl | 4.91 g |
| H2O | 200 mL |
終濃度 | 全量 250 mL |
2.5 % Triton X-100 | 100 % Triton X -100 を 6.25 mL |
50 mM Tris-HCl | 1 M ストック溶液を 12.5 mL |
5 mM CaCl2 | 2 M ストック溶液を 625 μL |
1 μM ZnCl2 | 0.1 M ストック溶液を 2.5 μL |
アジ化ナトリウム を含む H2O | 2 % NaN3 2 mL + H2O 228 mL |
終濃度 | 全量 250 mL |
1 % Triton X-100 | 100 % Triton X-100 を 2.5 mL |
50 mM Tris-HCl | 1 M ストック溶液を 12.5 mL |
5 mM CaCl2 | 2 M ストック溶液を 625 μL |
1 µM ZnCl2 | 0.1 M ストック溶液を 2.5 μL |
アジ化ナトリウム を含む H2O | 2 % NaN3 2 mL + H2O 233 mL |
全量 100 mL | |
メタノール | 40 mL |
酢酸 | 10 mL |
H2O | 50 mL |
| Coomassie Blue（クマシー・ブルー） | 0.5 g |
全量 1 L | |
メタノール | 400 mL |
酢酸 | 100 mL |
H2O | 500 mL |