細胞凍結保存 ビデオ・プロトコール
哺乳動物細胞株は適切に凍結保存すれば、数ヶ月～数年後に解凍するまで維持することができます。細胞へのダメージを抑え、遺伝子変化が最小になるような凍結保存法をご紹介します。
時間 ： 3 分 24 秒.
ダイジェスト
器具と試薬
- 凍結保存用バイアル（1-2 mL）
- CoolCell® freezing unit（BioCision 社）
- 凍結保存液
凍結保存
- 凍結保存するバイアルに、日付、作業者名、細胞数、継代数、細胞名、その他情報（遺伝子改変など）を記入する。
- 接着細胞の場合は、細胞培養液を除いて PBS で洗浄後、細胞を覆うのに十分なトリプシンを加え、37 ℃ で約 2 分インキュベートする。FBS を含む細胞培養液に再縣濁し、50 mL ファルコン・チューブに移す。
- 浮遊細胞の場合は、必要量を 50 mL ファルコン・チューブに直接移す。
- 血球計算盤で、細胞数および生存率を計測する。細胞凍結保存には、生存率は 75 % 以上であることが望ましい。血球計算盤の使用法はこちらをご参照ください。
- 室温で 1000 rpm 5 分間遠心する。
- 凍結保存液を準備する（表 1）。
- 上清を除き（凍結保存液として使用する場合は捨てずに保管：表 1 参照）、タッピングによりペレットをほぐす。
- 凍結保存液を 1 x 106 cells/mL になるよう加える。なお、凍結保存液に縣濁した細胞は、室温で 10 分以上放置することのないようにする。
- 凍結保存バイアルに 1 mL ずつ分注し、しっかりと蓋を閉める。
- 凍結保存バイアルを室温状態の CoolCell® に入れ、-80 ℃ の冷凍庫に移す。CoolCell® はこの条件で、1 分間に 1 ℃ ずつ温度が低下する。
- 約 24 時間後に、凍結保存バイアルを CoolCell から、液体窒素に移し長期保管する。
細胞の種類 | 凍結保存液 | 注意点 |
血清入り培地での培養細胞 | 90 % FBS + 10 % DMSO | よく混和し、37 ℃ に温めておく。 |
無血清培地での培養細胞 | 90 % 培養上清 + 10 % DMSO | Step7 の培養上清を使用する。よく混和し、37 ℃ に温めておく。 |
DMSO が不適な細胞 | 90 % FBS + 10 % グリセロール | よく混和し、37 ℃ に温めておく。 |
表 1. 哺乳動物細胞株の凍結保存液
凍結細胞の融解
- 液体窒素から取り出した細胞凍結バイアルを、37 ℃ の温浴で、80 % 程度融解させる（通常 1 分以上はかからない）。
- ピペットマンで、バイアルから細胞液を取り出し、予め約10 mL の培地を入れて温めておいた15 mL ファルコン・チューブに移します。
- 500 - 1,000 rpm で 5 分遠心して上清を除いた後、適量の培地で再縣濁する。
- 細胞縣濁液をフラスコやシャーレに移し、37 ℃ インキュベーターで培養する。