血球計算盤を用いた細胞数のカウント法

血球計数板（Hemocytometer; ヘモサイトメーター）を用いて培養細胞中の生存細胞数をカウントするプロトコールをご紹介します。

PDF 版のプロトコール（英語）は こちら

血球計算盤の準備

1. ガラス製の血球計算盤とカバースリップを使用する場合は、使用前に共にエタノールで洗浄し、風乾させておく。カバースリップを軽く水で湿らせ、血球計算盤に密着させる。適切に密着していれば、カバースリップの下にニュートン・リング（虹のような環）を見ることができる。
2. ディスポーザブルの血球計算盤（INCYTO DHC-N01 など）を使用する場合は、使用前に包装から出すだけでよい（洗浄の必要はない）。

サンプルの調製

1. 細胞を均一に分散させるために、フラスコを静かに旋回させる。
2. 細胞が沈降する前に、5 mL の滅菌ピペットを用いて約 0.5 mL の細胞懸濁液を取り、エッペンドルフ・チューブに入れる。
3. チューブから正確に 100 μL 分の細胞懸濁液を取り、別のエッペンドルフ・チューブに入れ、そこに PBS または生理食塩水で希釈した 0.4 ％ トリパンブルー（Trypan Blue）溶液 400 μL を加える（5 倍希釈となる）。静かに混和し、すぐにカウントに移る。

カウント

1. トリパンブルーを加えた細胞懸濁液 100 μL をピペットで取り、カウンティング・チャンバー（血球計算盤とカバースリップの隙間）に満たす。液を満たす際は毛細管現象を利用して静かに行い、決して無理に流し込んではいけない。
2. 10 倍対物レンズの顕微鏡を用い、フォーカスを血球計算盤のグリッドライン合わせる。
3. 16 個の正方形から成る 1 区画（図1）内の生細胞（トリパンブルーが取り込まれていない透明な細胞）を、カウンター（Hand tally counter）でカウントする。4 辺の境界線上にある細胞は、2 辺（例えば下と右）のみカウントする。なお細胞の生存率を計算する場合は、トリパンブルーを取り込んで染色された死細胞も別途カウントする。
4. 同じ作業を、4 隅にある 4 箇所の区画について行う。

生存率

生細胞数の計算

1. 4 箇所の細胞数の平均を求める。
2. 平均値を 10,000（10⁴）倍する（カウンティング・チャンバー内 1 区画に該当する液量が 10^-4 mL であるため）。
3. その値を 5 倍する（トリパンブルー溶液で 5 倍希釈しているため）。
   
   
   

この値が細胞懸濁液中の 1 mL あたりの生存細胞数（細胞濃度 cells/mL）となる。

計算例： 

• 4 区画それぞれでカウントされた細胞数が 50、40、45、52 であった場合
• (50 + 40 + 45 +52) ÷ 4 = 46.75
• 46.75 x 10,000 = 467,500
• 467,500 x 5 = 2,337,500 = 2.34 x 10⁶（cells/mL）

細胞生存率の計算

1. 生細胞数と死細胞数を上記計算法それぞれ求め、足した値を全細胞数とする。
2. 生細胞数を全細胞数で割る。

計算例：

• 生細胞が 2,337,500（cells/mL）、死細胞が 50,000（cells/mL）であった場合
• 2,337,500 + 50,000 = 2,387,500（cells/mL）

2,337,500 ÷ 2,387,500 x 100 = 97.9（細胞生存率 %）

図1. 血球計算盤のグリッドラインと 1 区画
4 隅にある 16 個の正方形を 1 区画としてカウントする。