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細胞増殖の検出、カウント、解析に必要な技術と実験ツール
培養細胞や組織における増殖細胞の検出は、化合物の毒性や腫瘍の予後を判別・予測する際などで、広く行なわれます。その増殖細胞の検出に用いられる方法としては、DNA 合成(DNA に取り込まれたプローブ)の検出、細胞代謝能の測定、増殖細胞マーカー・タンパク質の検出などがあります。
増殖細胞の検出ツール
DNA 合成の検出における代表的なプローブは BrdU(5 – ブロモ - 2' - デオキシウリジン)ですが、経時変化を観察する場合には IdU/CldU(5 - ヨード - 2' - デオキシウリジン/5 – クロロ - 2' - デオキシウリジン)が、生細胞を用いる場合には EdU(5 - エチニル - 2' - デオキシウリジン)が、それぞれ適しています。
細胞代謝能の測定で最も一般的な手法は MTT(Thiazolyl blue tetrazolium bromide)ですが、この他に XTT、WST-1 などがあり、感度などの特性が異なります。
増殖細胞マーカー・タンパク質の代表である Ki67 を抗体で検出する方法は、基礎研究と臨床研究、どちらの分野においても豊富な実績があり、確立されていますが、実験の目的によっては PCNA や MCM-2 に対する抗体も使用されます。
種類 | マーカー | 特性とメリット | デメリット | おすすめ製品 |
DNA 合成 | BrdU | G1 期、S 期、G2/M 期それぞれにいる細胞の割合や、細胞周期の動態を検出するのに有用。 | 抗体での検出には DNase、熱、酸などによる DNA 変性処理が必要。 DNA 変性処理により DNA や他の抗原の構造を壊す場合があり、他のターゲットとの多重染色には適さない。 | BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) (ab142567) Anti-BrdU antibody [BU1/75 (ICR1)] (ab6326) |
IdU および CldU | DNA 複製フォークの進行速度、安定性、複製起点の点火の研究に有用。 二種類のプローブを同時に用いることで、経時変化の観察など複雑な研究が可能。 | 抗体での検出には DNase、熱、酸などによる DNA 変性処理が必要。 DNA 変性処理により DNA や他の抗原の構造を壊す場合があり、他のターゲットとの多重染色には適さない。 | Anti-BrdU antibody [BU1/75 (ICR1)] (ab6326) | |
EdU | G1 期、S 期、G2/M 期それぞれにいる細胞の割合や、細胞周期の動態を検出するのに有用。 抗体による検出とそれに伴う変性処理が必要なく、よりシンプルなプロトコール。 | 値段が高い。 | 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (5-EdU) (ab146186) | |
細胞代謝能 | MTT | 細胞呼吸を定量測定し、間接的に増殖細胞を検出 シンプルなプロトコール | 細胞増殖を直接測定しているわけはない。 細胞傷害性がある。 不溶性なので培地添加前に溶媒への溶解が必要。 エンドポイントでの測定のみ可能(経時変化を追うことはできない)。 | |
XTT | 細胞呼吸を定量測定し、間接的に増殖細胞を検出。 シンプルなプロトコール。 MTT より高感度。 | 細胞増殖を直接測定しているわけはない。 実験条件により感度が変わる。 | ||
WST-1 | 細胞呼吸を定量測定し、間接的に増殖細胞を検出。 シンプルなプロトコール。 XTT よりさらに高感度。 | 細胞増殖を直接測定しているわけはない。 | ||
増殖細胞マーカータンパク質 | PCNA | G1 後期および S 期にいる細胞の検出に有用。 一部腫瘍においては予後予測に有用。 | 結果の解釈が主観的になる可能性がある。 Ki67 に感度や特異性で劣る。 | |
Ki67 | G1 期、S 期、G2 期、M 期の細胞の検出に有用。 一部腫瘍においては予後予測に有用。 実績やデータが豊富。 | 結果の解釈が主観的になる可能性がある。 一部の腫瘍においては MCM-2 に感度や特異性で劣る。 | ||
MCM-2 | G1 期、S 期、G2 期、M 期の細胞の検出に有用。 一部腫瘍においては予後予測に有用。 | 結果の解釈が主観的になる可能性がある。 |
増殖細胞を検出するために最も確実な方法は、細胞の DNA 合成を検出することです。それには、DNA 合成が行なわれる際に DNA に取り込まれる(細胞・DNA をラベルする)、チミジン・アナログ(チミジン類似物質)などのプローブを細胞と共に培養し、取り込まれたプローブを検出する方法があります。
プローブとして広く用いられているチミジン・アナログとしては、5 – ブロモ - 2' - デオキシウリジン(BrdU)があります。また、5 - ヨード - 2' - デオキシウリジン(IdU)、5 – クロロ - 2' - デオキシウリジン(CldU)、5 - エチニル - 2' - デオキシウリジン(EdU)といった化合物も使用されます。このようなチミジン・アナログは DNA 合成を行なう細胞に効率よく取り込まれますが、DNA へのダメージ、細胞の変異、細胞周期への影響などが起こることがありますので注意が必要です1,2。チミジン・アナログの検出は、抗体を用いた方法の他、プローブに標識された蛍光色素や RI などを直接検出する方法もあり、免疫組織染色(IHC)、免疫細胞染色(ICC)、ELISA、フローサイトメトリーなど、さまざまなアプリケーションで行なわれます。また、マルチプレックスに対応しているキットを用いれば、ハイスループットな検出も可能です。
チミジン・アナログを用いた DNA 合成検出の特徴には、次のようなものがあります。
BrdU | |
BrdU を取り込ませた Ramos 細胞株移植組織 FFPE 切片を、BrdU 抗体(ab1893)を用いて免疫組織染色で検出。 |
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IdU および CldU | |
IdU を取り込ませたマウス大腸組織の FFPE 切片を、IdU 抗体(ab187742)を用いて免疫組織染色で検出。 |
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EdU | |
DNA に取り込まれた BrdU を抗体で検出するには DNA 変性処理が必要だが(左)、DNA に取り込まれた EdU には蛍光色素を直接結合させることが可能(右; クリック・ケミストリー)。 |
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関連製品
テトラゾリウム塩で細胞の代謝活性を測定することにより、間接的に細胞増殖を計測することができます。テトラゾリウム塩は代謝活性が存在する環境で色素を形成します。その培地の色の変化を分光光度計で定量し、細胞増殖の指標とします。
感度が良い一方、通常の培地には不溶で、生成される色素も結晶化してしまうようなテトラゾリウム塩があり、その場合は毒性の心配がある DMSO やイソプロパノールなどの溶媒で溶解しなくてはなりません。ただし、現在では培地に可溶で、かつ毒性がないテトラゾリウム塩も知られています。
MTT | |
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XTT | |
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WST-1 | |
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関連製品
増殖細胞の検出には、増殖細胞で特異的に発現し、非増殖細胞では存在しないタンパク質を検出するという方法もあります。このようなタンパク質は通、細胞周期の G0 期以外おいて核の内部あるいは周辺部に存在しており、そのタンパク質に特異的な抗体を用いて、免疫組織染色などで検出することができます。こうした用途で使用できるタンパク質として最も実績が豊富なのは Ki67 で、がんの診断や予後予測に有用であるとされ、病理診断のマーカーとして日常的に用いられています。PCNA もマーカーとしてよく利用されるタンパク質ですが、感度と特異性の点で Ki67 の方が優れているという報告が多いようです3-6。最近では、がんの予後予測に関して言えば Ki67 や PCNA よりも、MCM2 の方が優れていると主張する報告もあります7,8。
しかしながらどのタンパク質が、細胞増殖を検出する上で最も優れているか、また臨床用のマーカーとして最も有用か、決定的と言えるデータはまだありません。
以下に、細胞増殖マーカー・タンパク質を利用した、免疫組織染色による検出の特徴をまとめました。
PCNA | |
ゼブラフィッシュ腸の凍結切片を PCNA 抗体(ab29)で染色。 |
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Ki67 | |
マウス脾臓のホルマリン固定パラフィン切片を Ki67 抗体 (ab15580) で染色。 |
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MCM-2 | |
ヒト小細胞肺癌のホルマリン固定パラフィン切片を MCM2 抗体(ab4461)で染色。 |
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増殖細胞の検出は、癌の悪性度や進行度の推測などを目的とし、臨床の場でも行なわれます。しかしながら細胞代謝能の測定や DNA 合成の検出は、臨床検体では困難です。そこで、増殖細胞の目視や機器などによるカウントも行なわれます。そのカウントもいくつかの方法があり、それぞれ一長一短があります。それらを下の表にまとめました。その中でアブカムがお勧めするのはグリーンで示した、免疫組織染色による「画像をマニュアルでカウント」の方法です。
方法 | 所要時間 | 簡便性 | 正確性 | 追加コスト |
目測 | < 1 分 | 最も高い | とても低い | なし |
顕微鏡下でのカウント | ~ 5 分 | 低い | 高い | なし |
画像でのカウント | ~ 10 分 | とても高い | 最も高い | なし~中程度(高性能カメラやプリンターなど) |
顕微鏡による自動カウント | ~ 5 分 | 低い | 中程度 | 高い |
ソフトウェアによる自動カウント | ~ 3 分 | 中程度(ソフトウェアの知識が必要) | 中程度 | なし |
Reid et all. (2015)11 より改変
目測
スライドを低倍率(x10 対物)で顕微鏡観察し、増殖陽性細胞の割合をざっと見積もる方法です。細胞数のカウントは行いません。この方法は汎用性があり、簡便でコストもかかりません。しかしながら正確性は最も低い方法です。
顕微鏡下でのカウント
中程度の倍率(x20 対物)での顕微鏡観察下、増殖陽性細胞をカウントします。増殖陽性細胞が豊富に存在する領域、いわゆる「ホット・スポット」に着目します。同じ細胞を二回以上カウントしてしまうようなミスを防ぐためには、グリッドなど病理検査でしばしば用いられるカウント用ツールを用います。
画像でのカウント
顕微鏡観察下での画像(通常は低倍率(x10 対物))のプリントアウトやスクリーン・キャプチャを用い、増殖陽性細胞をカウントします。二重カウントを防ぐために、プリントアウトであればマニュアルで、スクリーン・キャプチャであれば簡単なソフトを用いて、細胞にマークしていきます。
自動カウント
自動カウント顕微鏡を使用する場合と、画像解析ソフトを使用する場合があります。共にマニュアルで「ホット・スポット」を選び、その中の増殖陽性細胞を自動でカウントします。
自動カウント顕微鏡は高価であり、また不完全な染色における評価や大規模な較正に苦労する場合があります。画像解析ソフトは市販のものを使用するか、または National Institutes of Health(NIH)のウェブサイトで公開されている ImageJ のようなフリーのソフトウェアを使用します。
参考文献
1. Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D. & Rakic, P. Everything that Glitters Isn’t Gold: A Critical Review of Postnatal Neural Precursor Analyses. Cell Stem Cell 1, 612–627 (2007).
2. Anda, S., Boye, E. & Grallert, B. Cell-cycle analyses using thymidine analogues in fission yeast. PLoS One 9, 1–9 (2014).
3. Oka, S., Uramoto, H., Shimokawa, H., Iwanami, T. & Tanaka, F. The expression of Ki-67, but not proliferating cell nuclear antigen, predicts poor disease free survival in patients with adenocarcinoma of the lung. Anticancer Res. 31, 4277–4282 (2011).
4. Mateoiu, C., Pirici, A. & Bogdan, F. L. Immunohistochemical nuclear staining for p53, PCNA, ki-67 and bcl-2 in different histologic variants of basal cell carcinoma. Rom. J. Morphol. Embryol. 52, 315–319 (2011).
5. Salehinejad, J. et al. Immunohistochemical detection of p53 and PCNA in ameloblastoma and adenomatoid odontogenic tumor. J. Oral Sci. 53, 213–217 (2011).
6. Bologna-Molina, R., Mosqueda-Taylor, A., Molina-Frechero, N., Mori-Estevez, A. D. & Sánchez-Acuña, G. Comparison of the value of PCNA and Ki-67 as markers of cell proliferation in ameloblastic tumors. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal 18, (2013).
7. Carreón-Burciaga, R. G., González-González, R., Molina-Frechero, N. & Bologna-Molina, R. Immunoexpression of Ki-67, MCM2, and MCM3 in Ameloblastoma and Ameloblastic Carcinoma and Their Correlations with Clinical and Histopathological Patterns. Dis. Markers 2015, 8 pages (2015).
8. Joshi, S. et al. Digital imaging in the immunohistochemical evaluation of the proliferation markers Ki67, MCM2 and Geminin, in early breast cancer, and their putative prognostic value. BMC Cancer 15, 546 (2015).
9. Li, L. T., Jiang, G., Chen, Q. & Zheng, J. N. Ki67 is a promising molecular target in the diagnosis of cancer (Review). Mol. Med. Rep. 11, 1566–1572 (2015).
10. Szelachowska, J. et al. Mcm-2 protein expression predicts prognosis better than Ki-67 antigen in oral cavity squamocellular carcinoma. Anticancer Res. 26, 2473–2478 (2006).
11. Reid, M. D. et al. Calculation of the Ki67 index in pancreatic neuroendocrine tumors: a comparative analysis of four counting methodologies. Mod. Pathol. 28, 686–94 (2015).