ノックアウト（KO）細胞株での検証により裏付けられた抗体の特異性

​抗体が高い特異性を有しているかを確認するため、アブカムは、CRISPR/Cas9 遺伝子編集による KO細胞株での検証を行っています。検証済み抗体は、信頼性の高い研究結果をもたらします。

もしカスタムソリューションとCRISPR細胞株についてご興味がございましたら、11月25-27日に開催されるファーマEXPOに出展しますので、ぜひ、お越しください。また、リモートで、当社のチームと話すことができるバーチャルブースもご用意しております。

目次

• ノックアウト検証：重要性とソリューション
• ノックアウト検証：試験結果
• ノックアウト検証済み抗体と約束
• ノックアウト細胞株とライセート

重要性

抗体は、生命科学研究や臨床試験で最も一般的に使用されているツールの1つであり、さまざまな生物学的経路や疾患におけるタンパク質とその機能の研究に使用されています。
優れた抗体は高い標的特異性と検出感度を示し、目的タンパク質の発現レベルが低くても検出することができます。しかし、すべての抗体がこのような特異性をもつわけではなく、多くの抗体がオフターゲットタンパク質との交差反応性を示すことがわかってきています^１。これらの非特異的抗体は、リソースの浪費や、科学技術の発展を妨げる要因になりえます^2,3。

解決策：ノックアウト細胞による検証

抗体の特異性に関する最も受け入れられ信頼されている検証プロセスの1つは、ノックアウト（KO）サンプルによる検証です⁴。 KOサンプルによる検証とは、標的タンパク質を発現しないKO細胞株または組織で抗体をテストすることにより、抗体の特異性を確認できる非常に堅牢な手法です。組織を用いて、抗体の特異性を確認します。

​​​KO 細胞株と野生型（WT）細胞株のデータを比較すると、特異的な抗体は KO 細胞株ではシグナルが検出されず、WT細胞株（発現している場合）では特定のシグナルが検出されます。このようにKO 細胞株は、目的タンパク質に対する抗体特異性を確認するための、真のネガティブ・コントロールとなります^4,5。

​アブカムでは、抗体の検証を行うために、KO細胞株（ヒト半数体）の広範なライブラリーを使用しています。これらのKO細胞株はCRISPR-Cas9技術により作製され、サンガーシークエンシングにより検証されています。これらのKO細胞株は、1つの対立遺伝子KOとして完全な機能喪失モデルとなり、2倍体細胞モデルで見られるような別の対立遺伝子による干渉を排除します^6-8。

ノックアウト検証試験の結果

アブカムの抗体の KO 検証には、結果を評価するため主にウェスタン・ブロッティングを用います。ここでは、抗体試験から得られた異なるウェスタン・ブロッティングの結果と、それぞれの取扱いについてご紹介します。

特異性

• ​ 結果：KO サンプルでは予想分子量（MW）の位置にバンドが検出されない。
• 次のステップ：KO に基づく特異的データをデータシートに追加しました。抗体は特異性を備えていることが、KO検証により保証されました。

• 
• 図 1．Cdk4 RabMAb製品ab108357。KO サンプルでは、予想されたサイズの目的タンパク質のバンドは、KOサンプルでは消えます。
• 全レーン：抗 Cdk4 ウサギ・モノクローナル抗体 [EPR4513]（ab108357）、1000 倍希釈 

• レーン 1：野生型HAP1 細胞ライセート
  レーン 2：Cdk4 ノックアウト HAP1 細胞ライセート

  予想バンドサイズ：34 kDa
  検出されたバンドサイズ：34 kDa

  ローディング・コントロール抗体（赤）： 抗 beta Actin 抗体（ab8226）、1000 倍希釈​
  
  

  二次抗体：
  IR Dye 800 ヤギ抗ウサギ IgG (H + L)
  IR Dye 680 ヤギ抗マウス IgG (H + L)
  いずれも 10,000 倍希釈

   ​一部特異的 エクストラ・バンド

• 結果：KO では、予想 MW の位置にバンドは検出されないが、異なる MW にエクストラ・バンドが検出されている。
• 次のステップ：KO に基づく特異的データをデータシートに追加し、エクストラ・バンドを特定するため、追加の調査と試験を行います。

​​

図 2．Cdk6 マウス・モノクローナル製品ab54576。KO サンプルでは、予想分子量の位置にバンドが検出されていません。したがって、目的とするターゲットを認識しているということになります。しかしながら、どちらのサンプルでもエクストラ・バンドが検出されています。この原因としては、他のファミリー・タンパク質やアイソフォーム、または無関係のタンパク質に交差反応していることが考えられます。

全レーン：抗 Cdk6 抗体（ab54576）、1000 倍希釈

レーン 1：野生型HAP1 細胞ライセート
レーン 2：Cdk6 ノックアウト HAP1 細胞ライセート

予想バンドサイズ： 37 kDa
検出されたバンドサイズ：37 kDa

ローディング・コントロール抗体（赤）： 抗 beta Actin 抗体（ab8227）、1000 倍希釈

二次抗体：
IR Dye 800 ヤギ抗マウス IgG (H + L)
IR Dye 680 ヤギ抗ウサギ IgG (H + L)
いずれも 10,000 倍希釈

非特異的KOで弱いシグナル

• 結果：予想 MW の位置に、WT と比較すると弱いが、KO でもバンドが検出されている。ベンチマーク抗体は、WT ではターゲット・タンパク質のバンドを検出するが、KO では検出しない。 
• 次のステップ：KO に基づく特異的データをデータシートに追加し、KO サンプルのシグナルの原因を特定するため、追加の調査と試験を行います。
• 

• 図 3．Akt1 RabMAb® 製品ab32038。WT サンプルと比較すると弱いものの、KO サンプルでも、予想分子量の位置にバンドが検出されています。これには、ターゲット・タンパク質と同じ分子量の他のファミリー・タンパク質やアイソフォームと交差反応していることが考えられます。

  全レーン：抗 Akt1 ウサギ・モノクローナル抗体（ab32038）、1000 倍希釈

  レーン 1：野生型HAP1 細胞ライセート
  レーン 2：Akt1 ノックアウト HAP1 細胞ライセート

  予想バンドサイズ：55 kDa
  検出されたバンドサイズ：55 - 60 kDa

  ローディング・コントロール抗体（赤）： 抗 beta Actin 抗体（ab8226）、1000 倍希釈

  二次抗体：
  IR Dye 800 ヤギ抗ウサギ IgG (H + L)
  IR Dye 680 ヤギ抗マウス IgG (H + L)
  いずれも 10,000 倍希釈

• 非特異的抗体‐WTとKOサンプルの両方で目的バンドが検出されない​​

• 結果：KO で予想 MW の位置に、WT と同様の強さのバンドが検出されている。ベンチマーク抗体は 、WT ではターゲット・タンパク質のバンドを検出するが、KO では検出しない。

  次のステップ：対象抗体の販売を中止し、特異性が確認されている別の抗体を代替品としてお勧めします。

• 
  

   

  図 4．Akt1 ウサギ・ポリクローナル製品ab91505。KO で予想分子量（MW） の位置に、WT と同様の強さのバンドが検出されています。ベンチ・マーカー抗体は、WT ではターゲット・タンパク質のバンドを検出しますが、KO では検出されません。 

  全レーン：抗 Akt1 ウサギ・ポリクローナル抗体（ab91505）、1000倍希釈​

  ​レーン 1：野生型HAP1 細胞ライセート
  レーン 2：Akt1 ノックアウト HAP1 細胞ライセート

  予想バンドサイズ：55 kDa
  検出されたバンドサイズ：55 - 60 kDa

  ローディング・コントロール抗体（赤）： 抗 beta Actin 抗体（ab8226）、1000 倍希釈

  二次抗体：
  IR Dye 800 ヤギ抗ウサギ IgG (H + L)
  IR Dye 680 ヤギ抗マウス IgG (H + L)
  いずれも 10,000 倍希釈

•