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免疫組織化学染色 IHC のブロッキング

免疫組織染色(IHC)においては、バックグラウンドや偽陽性シグナルを低減するために、適切なブロッキング法を行ってください。

免疫組織染色において広く用いられているブロッキングである、タンパク質によるブロッキング、ビオチンのブロッキング、内因性酵素のブロッキング、自家蛍光の低減について、それぞれまとめました。ぜひご活用ください。


タンパク質によるブロッキング

血清、BSA(ウシ血清アルブミン)、スキムミルクなどのタンパク質を用いたブロッキングは、組織サンプルへの抗体の非特異的結合を防ぐために行います。理論的には、検出したいターゲットのエピトープへ結合しなければ、どのようなタンパク質でもブロッキング剤として用いることができます。

血清には抗体タンパク質(イムノグロブリン)が多量に含まれています。一次抗体や二次抗体が非特異的に結合しやすい組織サンプル中の部位、例えば Fc 受容体などには、血清中の抗体タンパク質もまた非特異的に結合しやすいので、血清はブロッキング剤として適しています。用いる血清の由来動物種は、二次抗体のホスト動物種と同じものを使用することをお勧めします。

ブロッキング剤として BSA やスキムミルクがよく用いられるのは、これらが比較的安価で入手できるタンパク質だからです(スキムミルクには多量のカゼインが含まれています)。これらは二次抗体の動物種に関わらず用いることができるので、よりシンプルなプロトコールになります。またこれらと動物血清を混合して用いることもよく行なわれます。

ブロッキング試薬として市販されている製品もあります。これらは組成が公開されていないことも多く、また比較的高価ですが、BSA などよりもブロッキングの能力や保存性の面で優れているようです。

マウス・オン・マウス染色

マウス由来の一次抗体をマウスの組織サンプルに使用する場合、一次抗体のマウス・イムノグロブリンを認識する二次抗体が、組織サンプル中の内在性イムノグロブリンや Fc 受容体に反応し、バックグラウンドが高くなる場合があります。これを抑えるためにはいくつかの方法があります。

1   標識二次抗体ではなく、直接標識一次抗体を使用する: 直接標識一次抗体が市販されていない場合には、Abcam Antibody Conjugation Kits などの標識キットを利用するのが便利です。

2   一次抗体と同じアイソタイプのイムノグロブリン以外を吸着処理した上で、一次抗体と同じアイソタイプに特異的な標識二次抗体を用いる。: 方法は下記をご参照ください。

Cattoretti G, Qing Fei. Application of the Antigen Retrieval Technique in experimental Pathology: from human to mouse. In Antigen Retrieval Techniques. Shi SR, Gy J and Taylor CR Editors. Eaton Publishing, Natick MA 2000. pp. 165-179.

3   一次抗体と二次抗体をプレ・インキュベートする。: 方法は下記をご参照ください。

Modified indirect immunodetection allows study of murine tissue with mouse monoclonal antibodies. J Histochem Cytochem. 1994 Nov;42(11):1499-502. PMID: 7930532. Finally, various "mouse-on-mouse" staining kits are available commercially.

4   F(ab) フラグメント二次抗体を利用する。: 方法はこちらをご参照ください。

5   アブカムの Mouse on Mouse IHC キットを用いる。


ビオチンのブロッキング

ABC 法などのアビジン-ビオチン結合反応を用いた系において、腎臓、肝臓、脳など内在性ビオチンを多く含む組織をサンプルとする場合には、この内在性ビオチンをブロッキングする必要があります。その方法はまずサンプルに何も標識されていないアビジンを反応させ、次にそのアビジン分子上のビオチン未反応のビオチン結合部位(アビジン分子上には 4 つのビオチン結合部位があります)をブロッキングするために、再度ビオチンを反応させます。この操作はアブカムのビオチン・ブロッキング試薬を用いると便利です。またこのような組織サンプルの場合には、ABC 法ではない IHC 用検出キット EXPOSE IHC detection kit を用いれば、ビオチンのブロッキングは必要ありません。

この操作におけるポイント:

  • 内在性ビオチンのブロッキングは、ビオチン標識二次抗体を反応させるより前に行うこと
  • ブロッキング試薬を反応させる前に、サンプルをブロッキング・バッファーで湿らせておくこと


内在性酵素のブロッキング

酵素抗体法において、検出に用いる酵素と同様の働きをする酵素が組織サンプル内にも存在する場合のブロッキングです。ここではよく用いられる酵素であるペルオキシダーゼ(HRP など)とアルカリ・フォスファターゼ(AP)のブロッキング法をご紹介します。

ペルオキダーゼのブロッキング

検出用酵素として HRP を用いた系において、ミエロ・ペルオキシダーゼが豊富に存在する赤血球を含む可能性がある、腎臓、肝臓、血管などの組織をサンプルとする場合には、内在性ペルオキシダーゼのブロッキングを検討してください。このブロッキングが必要かどうかを調べるには、組織サンプルに直接 DAB 発色基質を反応させてください。もしサンプルが茶色に染色されたら、内在性ペルオキダーゼが存在するため、ブロッキング操作を行なってください。ブロッキングは、過酸化水素 H2O2 を用いる方法が一般的です。

この操作におけるポイント:

1   このブロッキング操作は以下いずれかのタイミングでおこなってください。

  • 再水和と抗原賦活化の間
  • 抗原賦活化と一次抗体反応の間
  • 一次抗体反応と二次抗体反応の間

過酸化水素はターゲット・タンパク質のエピトープにダメージを与える場合があります。ターゲット・タンパク質が CD4 や CD8 など、ダメージを受けやすい場合には、ブロッキングは抗体反応の後に行うことをお勧めします。

2   一般的なプロトコールでは、反応は 0.3 % 過酸化水素で 10-15 分です。サンプル中に存在する血球の量、過酸化水素によるターゲット・タンパク質のダメージの受けやすさ、過酸化水素の濃度などによって、反応時間は 5-60 分の間で調整してください。

アルカリ・フォスファターゼのブロッキング

​検出用酵素としてアルカリ・フォスファターゼ(AP)を用いた系において、腎臓、腸、骨芽細胞、リンパ系組織、胎盤など内在性アルカリ・フォスファターゼを含む可能性がある組織(特に凍結切片)をサンプルとする場合には、アルカリ・フォスファターゼのブロッキングを検討してください。このブロッキングが必要かどうかを調べるには、組織サンプルに直接 BCIP/NBT 発色基質を反応させてください。もしサンプルが青色に染色されたら、内在性アルカリ・フォスファターゼが存在するため、ブロッキング操作を行なってください。

この操作におけるポイント:

1   発色基質にレバミソールを同時に加えることでブロッキングします。成分にレバミソールを含む発色基質も販売されています。

2   レバミゾールでは腸のアルカリ・フォスファターゼ(Intestinal AP)はブロッキングできません。腸を組織サンプルとして用いる場合には、一次抗体反応の前に組織を 1% 酢酸などの弱い酸で処理してください。

自家蛍光の低減

検出系に蛍光色素を用いる免疫蛍光染色の場合、組織が自家蛍光を発してバックグラウンドが高くなる可能性を考慮する必要があります。自家蛍光は組織サンプルに含まれるフラビンやポルフィリンといった蛍光物質が原因となります。またアルデヒド系の試薬で固定処理を行うと、アルデヒドとアミンが反応して蛍光物質が生成され、これが自家蛍光の原因となることもあります。このような蛍光物質は、パラフィン切片の場合の脱水処理や固定処理により組織から除かれますが、凍結切片の場合ほとんど水溶性の試薬でのみ調製されるため、蛍光物質はあまり除かれません。

自家蛍光を低減するためのポイント
方法 1: 固定による蛍光物質の生成を防ぐため、パラフィン切片ではなく凍結切片を用いる
方法 2: パラフィン切片を用いる場合の固定は、カルノー溶液などのアルデヒドを含まない溶液で行なう
方法 3: 水素化ホウ素ナトリウム、グリシン、リジンなどで固定液中の余分なアルデヒド基をブロックする
方法 4: Pontamine sky blue、Sudan black、トリパンブルー、FITC Protein Blocking Agent などのクエンチャー色素で組織を処理する
方法 5: どうしても自家蛍光が低減できない場合には、検出系を呈色に切り替える
  • FITC Protein Blocking Agent(ab128980

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