Lightning-Link®抗体標識キット：よくある質問（FAQ）| アブカム
サイエンティフィック・サポートのエキスパートがお答えする、よくある質問
質問
- 抗体の最適な開始濃度はいくつですか？
- 抗体標識キットを使用する前に抗体を精製する必要がありますか？
- 抗体標識キットはタンパク質および二次抗体に適していますか？
- どのバッファーを使用できますか？
- どのバッファー添加物を使用でき、どれを避けるべきですか？
- 抗体保存バッファーから添加物を取り除く方法を教えてください。
- アジ化ナトリウムは干渉を引き起こしますか？
- 抗体は高いpHに曝されますか？
- 最終的に得られる標識抗体を脱塩する必要はありますか？
- 標識した抗体はどのように保存しますか？
- BSAまたはゼラチンは抗体の標識反応に影響を与えますか？
- 使用している抗体が高分子量の凝集体を形成する可能性はありますか？
- どの程度の回収率を期待できますか？
- 標識抗体から、抗体に結合しなかったフリーの標識をどのように取り除きますか？
- 抗体濃縮キットとは何ですか？
- 抗体精製キットとは何ですか？
1. 抗体の最適な開始濃度はいくつですか？
抗体標識キットにより、マイクログラムからミリグラムのスケールで抗体のラベル化を行うことができます。抗体の量は、抗体と標識物を1：4〜1：1のモル比にする必要があります。キットサイズは、標識可能なIgGの量を示しています。それぞれの分子量に基づいて（例えば、平均的なIgGの場合160 kDa）、100-400μgの抗体を100μgの標識物に加えることができます。1-4mg / mlの抗体濃度で最適な結果が得られます。（0.5mg / mlがお勧めする最低の量です）10μg、100μg、1mgのキットフォーマットにそれぞれ10μl、100μl、1mlの抗体溶液を使用することをお勧めします。各Lightning-Link®抗体標識キットの抗体濃度は最適化されています。推奨される抗体濃度については、データシートまたはプロトコールを参照してください。
注：これらのルールは、PEおよびPEタンデム標識には適用されません。これらの色素に特有の推奨事項の詳細については、キットのデータシートまたはプロトコールを参照してください。
2. Lightning-Link®抗体標識キットを使用する前に抗体を精製する必要がありますか？
はい。抗体のラベル化反応には遊離アミン基が含まれます。ほとんどのタンパク質/ペプチドはリジンおよび/またはアルファ-アミノ基を持っているため、溶液中に存在するあらゆるタンパク質/ペプチドも標識されます。標識化を行う前に抗体を精製するか、あるいは精製された抗体を使用することをお勧めします。腹水、血清、またはハイブリドーマの培養液は、標識化を妨げる可能性があるため、避ける必要があります。互換性のあるバッファーとないバッファーに関しては質問5を参照してください。
3. Lightning-Link®抗体標識キットはタンパク質および二次抗体に適していますか？
はい。ラベル化反応は、リジンおよびタンパク質のN末端に存在する一級アミンをターゲットにします。すべての抗体には複数の遊離アミン基があり、ほとんどのタンパク質にはリジンおよび/またはアルファアミノ基があります。リジンを含まない一級アミンが存在する限り、二次抗体とタンパク質はLightning-Link®抗体標識キットで標識化されます。このキットは、利用可能なアミン基を持つ抗体、タンパク質、ペプチド、およびその他の生体分子で機能します。キットはIgGの標識用に最適化されています。分子量の違いを考慮しながら、標識用バイアルに加える材料の量を調整することをお勧めします。結合効率に影響を与える可能性があるため、これはバイアルに追加する容量を変更せずに行う必要があります。大まかなガイドラインとして、IgGとのサイズの違いに比例して材料の量を変更することをお勧めします。平均IgGは約160kDであるため、抗体の約半分（約80kD）の大きさのターゲットの場合は、バイアルに1/2の量を追加します。これは単なるガイドラインであり、アッセイに最適な量は実験的に求める必要があることにご注意してください；当社の3x10µgキットを使用すると、少量の材料を使用、すなわち低コストで行うことができます。
注：引き続き通常の要件が適用されます。ターゲットは、適切なアミンフリーのバッファーで精製し、アジド、BSA、トリス、グリシンなどの添加物を含まないようにする必要があります。
4. どのバッファーを使用できますか？
Hepes、MES、MOPS、リン酸ベースのバッファー、またはその他のアミンフリーのバッファーの使用をお勧めします。結合反応は、カップリング効率をほとんど低下させることなく、最大20 mMのTrisバッファーの存在下でも行うことができます。反応が完了したら、標識と抗体の両方に適合するバッファーに標識抗体を希釈できます。バッファーの推奨pHは6.5〜8.5です。
5. どのバッファー添加物を使用でき、どれを避けるべきですか？
塩（例：NaCl）、糖（例：スクロース）、キレート剤（例：EDTA）などの添加剤は、標識反応に影響を与えません。共役反応を妨げる可能性のあるアミノ酸（グリシンなど）、ブロッカー（エタノールアミンなど）、チオール（DTT、メルカプトエタノール）などの求核試薬を避けることをお勧めします。
適合添加物：
- 最大20mM Tris
- 最大0.1% BSA (最大1％のBSAは機能しますが、標識物の品質は低下します)
- 最大0.1% ゼラチン
- 最大0.1% アジ化ナトリウム
- PBS pH6.5-8.5
- 最大50% グリセロール
- 0.15M 塩化ナトリウム
- 50mM HEPES
- 0.02M potassium phosphate
- 0.001% Tween
- Proclin 300
- 5% Trehalose
不適合添加物：
- 20mM以上のTris
- 尿素
- 50mMイミダゾール
- グリシン
- エタノールアミン
- DTT
- メルカプトエタノール
- その他のチオール
6. 抗体保存バッファーから添加物を取り除く方法を教えてください。
アブカムの抗体濃縮および精製キットは、Lightning-Link®抗体標識キットと互換性があり、添加物を簡単に除去できる直ぐに使用可能なソリューションです。
- 抗体濃縮キットは、アジド、グリシン、およびTrisの濃縮と還元を容易にします。
- 抗体精製キットは、BSA、グリシン、トリス、アジドなどをすばやく除去し、腹水または免疫血清から抗体を精製するためにも使用できます。
濃縮キットと精製キットの詳細は質問15〜16をご覧ください。
7. アジ化ナトリウムは干渉を引き起こしますか？
アジ化ナトリウムは、結合反応中に干渉する可能性があります。最大0.1％の濃度のアジ化ナトリウムをお勧めします。しかしながら、アジ化ナトリウムはHRPの不可逆的な阻害剤として知られています。アジ化ナトリウムの存在下でHRP標識を行うことや、HRP標識抗体にアジ化ナトリウムを添加することはお勧めしません。さらに、最高品質の標識物を得るためには、アジ化ナトリウムを可能な限り避け、アブカムの精製キットを使用して除去することをお勧めします。
8. 抗体は高いpHに曝されますか？
Lightning-Link®抗体標識キットは分子を高いpHに曝しません。標識反応は生理学的pHで行われます。
9. 最終的に得られる標識抗体を脱塩する必要はありますか？
いいえ。WB、ELISA、IHCや、通常二次抗体を使用する他のアプリケーションでは、標識抗体をすぐに使用できます。
10. 標識した抗体はどのように保存しますか？
標識する抗体によって、グリセロールを使用して-20ºCで、または適切な添加剤を使用して4 ºCで長期保存できます。
抗体が50%グリセロールで-20℃保存できる場合には、標識済み抗体は2年間安定して保存できます。また APCおよびR-PE標識済み抗体は、グリセロール無しで-20 ºCで保存しないでください。 希釈も影響を及ぼすため、可能であれば標識済み抗体を希釈せずに保存することをお勧めします。
4 ºCでの長期保存には、抗菌剤や安定剤（アジ化ナトリウム、BSA、グリセロールなど）を添加することをお勧めします。抗体が4 ºCで保存できる場合、標識済み抗体は12〜18か月間4℃で安定です。但し、タンデムコンジュゲートでは最大3か月間、安定です。
11. BSAまたはゼラチンは抗体の標識反応に影響を与えますか？
最大0.1％BSAと0.1％ゼラチンは標識反応にほとんど影響を与えません。
12. 使用している抗体が高分子量の凝集体を形成する可能性はありますか？
いいえ。標識化プロセスは抗体を凝集させません。
13. どの程度の回収率を期待できますか？
抗体標識反応全体が1本のチューブに含まれています。回収率はほぼ100％です。
14. 標識抗体から、抗体に結合しなかったフリーの標識をどのように取り除きますか？
Lightning-Link®抗体標識キットは、反応の最後に出るフリーラベルが微量となる様に設計されています。したがって、ろ過のステップは必要ありません。残余のフリーラベルは、キットに含まれるクエンチャーによって反応基がブロックされ、お客様のアプリケーションに含まれるウォッシュ・ステップで洗い流されます。
15. 抗体濃縮キットとは何ですか？
アブカムの抗体濃縮キットを使用すると、抗体やタンパク質を簡単に濃縮できます。また、アジド、グリシン、トリスなどの多くの不要な不純物の濃度を下げ、さらにバッファー交換を行うためにも使用できます。
16. 抗体精製キットとは何ですか？
アブカムの抗体精製キットは、BSA、アジド、グリシン、トリスなどをすばやく除去し、抗体をタンパク質Aレジンに結合させることにより、腹水または全血清から抗体を精製するためにも使用できます。精製キットは組織培養上清などの大容量の精製には適していません。 TCSおよび血清については、TCSおよび血清特異的抗体精製キットをご覧ください。
さらに詳しい情報やサポートに関しては、テクニカル・サポートにご連絡下さい。