- DNA を適当な長さに断片化するためには、ライセートのソニケーションはどのように行えばいいですか？
- 免疫沈降に必要なターゲット・タンパク質の量はどれくらいですか？
- 免疫沈降に必要な抗体の量はどれくらいですか？
- 架橋をするときに大事なポイントは？
- 架橋を解離させる反応条件はどうすればいいですか？
1. DNA を適当な長さに断片化するためには、ライセートのソニケーションはどのように行えばいいですか？
5 分、10 分、15 分、20 分とソニケーション時間を延ばしていくと、DNA 断片のサイズは小さくなっていきます。免疫沈降 IP を行う前に、ソニケーション時間と DAN 断片のサイズのタイムコースをとって、最適な長さになるような条件を探してください。DNA 断片のサイズは、10 ul のサンプルを 1.5％アガロースゲル電気泳動にかけて確認できます。なお、ソニケーションは必ず、サンプルを氷上で冷やしながら行ってください。
注：ソニケーション時間を延ばすと DNA 断片のサイズは小さくなっていきますが、時間を延ばしすぎると DNA がヌクレオソームからはずれてしまい、アガロースゲル上のサイズが 200 bp 以下になりません。
2. 免疫沈降に必要なターゲット・タンパク質の量はどれくらいですか？
1 回の実験に約 25 ug のタンパク質が必要です。RIPA バッファーで 10 倍希釈したサンプルのタンパク質濃度を、ブラッドフォード法などで定量してください。
3. 免疫沈降に必要な抗体の量はどれくらいですか？
最適な抗体量は条件設定を行って求めてください。最初に 25 ug のターゲット・タンパク質に対して 3～5 ug の抗体を加え、反応が認められなかった場合、10 ug 程度まで抗体量を増やしていってください。
なお、ChIP には一般的にモノクローナル抗体よりもポリクローナル抗体の方が適しています。モノクローナル抗体は 1 種類のエピトープしか認識しませんが、ポリクローナル抗体は複数のエピトープを認識します。X-ChIP 法で架橋処理を行い、あるエピトープが変性してしまったとしても、ポリクローナル抗体なら他のエピトープを認識する可能性があるので、全く反応しなくなるといったことが起こりにくくなります。
4. 架橋をするときに大事なポイントは何ですか？
架橋反応は反応時間がポイントになります。10 分以内で行ってください。反応時間が長すぎるとタンパク質‐DNA 間の結合が切れたり、エピトープが変化したりする可能性が高くなります。それにより抗体とのアフィニティが低下することもあり得ます。
5. 架橋を解離させる反応条件はどうすればいいですか？
架橋の解離には 5M NaCl を使い、65℃ で 4 時間から一晩反応させます。4 時間より短いと架橋が解離しないことがあります。