Immunoprecipitation FAQ

よくある質問: IP (免疫沈降)

  1. どのくらいの量のサンプルと抗体が必要ですか?
  2. IP で精製したタンパク質に対してウェスタンブロットを行ったら、2 本のバンドが検出されました。どうしてですか?
  3. IgM を用いて免疫沈降を行いたいのですが、プロテイン A または G 固定化ビーズは使用できますか?

1. どのくらいの量のサンプルと抗体が必要ですか?

必要なサンプル量は、細胞ライセートで 10-500 ug 程度です。この量は、ターゲット・タンパク質の発現量や抗体のアフィニティを考慮して調整してください。必要な抗体量は下記をご参照下さい。データシートに推奨される具体的な抗体濃度が記載されている場合もあります。

ポリクローナル抗体を含む抗血清: 1–5 μl
アフィニティ精製ポリクローナル抗体: 1 μg
モノクローナル抗体を含む腹水: 0.2–1 μl
モノクローナル抗体を含む培養上清: 20–100 μl

2. IP で精製したタンパク質に対してウェスタンブロットを行ったら、2 本のバンドが検出されました。どうしてですか?

ターゲット・タンパク質を溶出する際に、抗体タンパク質も同時に溶出されてきた可能性があります。ビーズに固定化した抗体タンパク質は、共有結合で架橋して用いることをお勧めします (抗体を架橋する方法はこちらをご参照ください)。また溶出を行う際には、グリシン・バッファーのような穏やかな溶出液を用いることをお勧めします。

3. IgM を用いて免疫沈降を行いたいのですが、プロテイン A または G 固定化ビーズは使用できますか?

使用できません。プロテイン A や G 固定化ビーズの代わりにプロテイン L 固定化ビーズを使用してください。もしくは、プロテイン A または G 固定化ビーズに、まずアイソタイプが IgG の Anti-IgM 抗体を結合させ、そこにさらに IgM を結合させます。IgM を用いた免疫沈降法はこちらをご参照ください。

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