DNA methylation

DNA メチル化ガイド

DNA のメチル化は、DNA 鎖の塩基の一つにメチル基を付加する反応で、重要なエピジェネティク修飾です。


DNA メチル化(DNA methylation)は多くの生物学的現象に関与するプロセスです。例えば原核生物においては、病原性、細胞サイクルの制御、遺伝子発現、外来性 DNA の侵入に対する防御(DNA-宿主特異性)などに関与しています。真核生物においては、クロマチンの安定性、刷り込み、X 染色体の不活化、発がんなどに関与しています。

哺乳類において DNA メチル化は、主としてシトシン(Cytosine)残基の 5 位の炭素に起こり、5-メチルシトシン(5-methylcytosine)または 5-メチルシチジン(5-methylcytidine; 5-mC)となります。これが認められる箇所は CpG ジヌクレオチドにほぼ限られ、エピジェネティックの重要なマーカーとなります。またここは遺伝子発現調節因子でもあり、遺伝子プロモーターでのメチル化 CpG クラスター、または CpG アイランドは遺伝子不活化に関与しています。

DNA メチル化は DNMT1、DNMT3a、DNMT3b といった DNA メチルトランスフェラーゼ(DNA methyltransferases)と呼ばれる酵素ファミリーによって行われます。DNMT3a と DNMT3b はデノボメチルトランスフェラーゼ(de novo methyltransferases)とも呼ばれ、これまでにメチル化されていなかった CpG をメチル化することができます。一方 DNMT1 は維持用メチルトランスフェラーゼ(Maintenance methyltransferase)と呼ばれ、複製中にヘミメチル化 DNA(Hemi-methylated DNA)を修飾します。

DNA methylation and demethylation

図 1. DNA メチル化と脱メチル化の概要


DNA 脱メチル化(DNA demethylation)は、Tet1、Tet2、Tet3 などの Tet ファミリーの酵素が関与し、5-mC → 5-ヒドロキシメチル化シトシン(5-hydroxymethyl-cytosine; 5-hmC)→ 5-ホルミル化シトシン(5-formyl-cytosine; 5-fC)→ 5-カルボキシ化シトシン(5-carboxy-cytosine; 5-caC)→ シトシン(Cytosine)という連続的な酸化のプロセスで行われると考えられています(図 1)。塩基除去修復(Base excision repair; BER)経路における糖分解酵素である TDG も、上記とは別の経路で脱メチル化に関与していることが近年見出されました。この経路は 5-hmC の脱アミノ化から生じる可能性のある 5-ヒドロキシメチルウラシル(5-hydroxymethyluracil)を修復することができます。


DNA メチル化を解析するアプローチ

多くの手法が考案されていますが、ここでは 3 種類ほど簡単にご紹介します。


亜硫酸水素ナトリウム処理(Sodium bisulfite modification)

Sodium bisulfite(亜硫酸水素ナトリウム)処理は、シトシンのメチル化を解析するための有用なツールの一つです。これにより DNA におけるメチル化パターンを決定することができます。この手法を利用して次世代シークエンシング(NGS)と組み合わせ、特定の領域のみならず、全ゲノムに渡ってメチル化のマッピングを作製するという試みもあります。

Overview scheme of bisulfite conversion

図 2. Sodium bisulfite 処理を利用したDNA メチル化の解析


DNA を Sodium bisulfite で処理すると、シトシン残基(C)は脱アミノ化され、ウラシル(U)へと変換される一方、メチル化されたシトシン残基(mC)は変換されない。処理後に PCR を経てシークエンシングを行うとその配列は、DNA メチル化が認められない領域では処理前後で異なる一方、DNA メチル化が認められる領域では処理前後で変化は認められない。


配列特異的酵素処理(Sequence-specific enzyme digestion)

この手法は制限酵素のうち、メチル化感受性がある(基質の DNA がメチル化されると DNA 切断活性が低下する)酵素と、メチル化感受性のない酵素を利用します。そしてメチル化されている領域を同定するために、DNA シークエンシング、マイクロアレイ、PCR、サザンブロッティングとなどと組み合わせて行われます。


メチル化 DNA の捕獲(Capture/quantification of methylated DNA)

DNA-結合タンパク質やメチル化 DNA 認識抗体など、メチル化 DNA と特異的に結合するタンパク質を利用した手法もあります。

例えば特異的な抗体をマイクロプレートに固相化し、ELISA 様の手法でメチル化 DNA とヒドロキシメチル化 DNA の構成比を測定することができます。またメチル化 DNA 抗体をマイクロ・ビーズに固相化し、免疫沈降させて集める MeDIP(Methylated DNA Immunoprecipitation)という手法もあります。





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