ウエスタン・ブロッティング・トレーニング 第三週:最適化とトラブルシューティング

アブカムのウエスタン・ブロッティング・トレーニング・シリーズへようこそ。

トレーニング・シリーズの第三週では、トラブルシューティングやよくある質問について確認します。さらに、ヒストンやリン酸化タンパク質の検出法について説明します。


Overview

3.1 トラブルシューティング
3.2 ウエスタン・ブロッティングに適した二次抗体
3.3 FAQs
3.4 リン酸化タンパク質のウエスタン・ブロッティング
​3.5 ヒストンのウエスタン・ブロッティング


3.1 ウエスタン・ブロッティング・トラブルシューティング
全ての実験は異なるため、期待していた結果を得るために標準的なプロトコールに従うだけでは不十分であることがあります。ウエスタン・ブロッティングがどうしてもうまくいかない場合は、トラブルシューティングをご覧ください。下のビデオでは、よくあるトラブル(No シグナル、高バックグラウンド、多数のバンド検出など)について、その対策をご紹介しています。





3.2 ウエスタン・ブロッティングに適した二次抗体
西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ(HRP)アルカリ・ホスファターゼ(AP)が標識された二次抗体を用いると、直接標識された一次抗体を用いる直接法より感度が増すことが考えられ、検出に非常に有利と言えます。

二次抗体についての詳細


3.3 ウエスタン・ブロッティング FAQs
あなたはすでに、このコースの主要なウエスタン・ブロッティングのステップを完了しているので、結果を得るために必要なことについては、かなり良いアイデアがあるはずです。しかし、まだ何かが難しいことや不明なことがある場合は、ここの FAQs を参考にして下さい。

質問の例

  • バンドサイズが予想されるものと異なるのはなぜ?
  • どのくらいの量のサンプルをロードすればいいの?
  • 組換えタンパク質を検出する際にバンドを得ることが難しいことがあります。これはなぜ?

ウエスタン・ブロッティング FAQs


3.4 リン酸化タンパク質のウエスタン・ブロッティング・プロトコール
もし“リン酸化”のようなタンパク質の翻訳後修飾にご興味があれば、慎重にサンプルを取り扱い、正しい試薬を使用してタンパク質の構造に気を配ることが不可欠です。タンパク質のリン酸化状態を保つために、バッファーにホスファターゼ阻害剤を加え、サンプルを常に氷上に置いておきます。またメンブレンをブロッキングする際、ブロッキング剤には milkではなく 5% w/v BSA を用いることが重要です。Milk には高レベルでリン酸化されているカゼインが含まれており、抗リン酸化抗体を用いる場合、高バックグラウンドになる恐れがあります。

プロトコールはこちら


3.5 ヒストンのウエスタン・ブロッティング・プロトコール
ヒストン・タンパク質は分子量が非常に低く、通常は約10〜20 kDaです。このため、ウエスタン・ブロッティングを行う際には注意が必要です。まず、高パーセンテージのゲルを使用して、ヒストン・タンパク質を明確に分離しなくてはなりません。電気泳動をはじめると比較的すぐにゲルから流出してしまいますので、泳動中にゲルの底から色素(dye)が流出しないよう注意してください。次に、使用するメンブレンですが、トランスファーの際にヒストン・タンパク質がきちんと捕捉されるように、0.2 µm のポア・サイズのニトロセルロース膜をご使用ください。

プロトコールはこちら



要約

あなたは既に様々なタイプのウエスタン・ブロッティングに対応することができるようになっています。

  • ヒストンのウエスタン・ブロッティング
  • タンパク質のリン酸化状態をキープする方法
  • いざという時のためのトラブルシューティングと FAQs


​第四週では、蛍光ウエスタン・ブロッティングを取り扱います。




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