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Alexa Fluor® 標識二次抗体 FAQ

1. 適切な保存温度を教えてください。

2. なぜ分注して保存すべきなのですか?

3. 保存に適した容器はどのようなものですか?

4. 抗体を希釈した上で保存することはできますか?

5. ブロッキング・バッファーにはどのような溶液を推奨しますか?

6. 抗原抗体反応の溶液は、どのようなものを使用したらいいですか?

7. 光は実験に影響を与えますか?

8. 蛍光標識抗体の反応に適した温度はありますか?また反応時間はどれくらいが適当ですか?

9. 蛍光標識抗体の希釈濃度はどのくらいが適当ですか?

10. バックグラウンドを低くするためにはどうすればいいですか?

11. 一度使用した二次抗体を繰り返し使用する事はできますか?

12. ネガティブ・コントロールには何を使用すればいいですか?

13. Alexa Fluor® 標識抗体は多重染色に使用できますか?

14. Alexa Fluor® 標識抗体を用いて多重染色を行う場合、どのような蛍光標識を選べばいいですか?

15. 多重染色を行う場合に抗体の交差反応を抑えるには、どのようにしたらいいですか?

16. 吸着処理済抗体とはどのようなものですか?

1. 適切な保存温度を教えてください。

1-2 週間程度であれば 4 ℃ です。それ以上の長期に保存する場合には分注した上で、-20 ℃ または -80 ℃ です。

2. なぜ分注して保存すべきなのですか?

コンタミの危険性を回避し、また凍結融解を繰り返すことによる力価の低下を防ぐためです。ただし溶液の蒸発や抗体タンパク質の溶液への吸着を避けるため、分注する容量は 10 μl 以上にしてください。

3. 保存に適した容器はどのようなものですか?

タンパク質の吸着が低い素材で、かつ遮光ができる容器を選んでください (蛍光色素は光に曝されると退色する恐れがあるため)。遮光ができる容器がない場合には、容器の外側をアルミホイルなどで覆ってください。

4. 抗体を希釈した上で保存することはできますか?

タンパク質は濃度が低くなるほど安定性が低下するのでお勧めしません。もしどうしても希釈した上で保存したい場合には、0.02% アジ化ナトリウム、1% BSA、および 30% グリセロールを含む PBS で希釈してください。

5. ブロッキング・バッファーにはどのような溶液を推奨しますか?

製品のデータシートに組成が記載されている場合には、それに従ってください。記載されていない場合には、ウエスタン・ブロッティングでは 5 % BSA または 5 % スキムミルクを、免疫蛍光染色および免疫細胞染色では二次抗体の動物種由来の血清 10 % を含む溶液、または 1 % BSA、または 1 % ゼラチンを、それぞれお勧めします。なおブロッキング・バッファーは、実験ごとに用事調製してください (作り置きはしないでください)。また、ブロッキング・バッファーの成分は、必ず完全に溶解させてください。望ましくはフィルターを通し、不溶物を完全に除去してください。

6. 抗原抗体反応の溶液は、どのようなものを使用したらいいですか?

バックグラウンドを低く抑えるためにブロッキング・バッファー (上記参照) または TBST (界面活性剤 Tween-20 を含むトリス緩衝食塩液 TBS) を用いてください。バックグラウンドに問題がない場合は、TBS または PBS (リン酸緩衝食塩液) で希釈したブロッキング・バッファーも使用できます。

7. 光は実験に影響を与えますか?

蛍光色素は一般に、光に曝されると蛍光強度が低下します (退色します)。Alexa Fluor® は比較的光の影響を受けにくい蛍光色素ではありますが、それでも光の暴露を避けるのに越したことはありません。蛍光標識抗体の反応中はアルミホイル等で遮光してください。

8. 蛍光標識抗体の反応に適した温度はありますか?また反応時間はどれくらいが適当ですか?

ウエスタン・ブロッティングや免疫蛍光染色/免疫細胞染色では室温 1 時間が目安です。サンプル中の抗原量が少ない場合や抗体の親和性が低い場合には、室温数時間、4℃ 一晩、といった条件も試してみてください。

9. 蛍光標識抗体の希釈濃度はどのくらいが適当ですか?

最適な希釈濃度は、実験条件、抗体の力価、サンプル中の抗原濃度など多くの要素で変わります。何点か段階希釈し、最適な濃度を探してください。最初は一次抗体濃度の 10 倍程度の希釈を試してみることをお勧めします。

10. バックグラウンドを低くするためにはどうすればいいですか?

蛍光標識抗体の希釈濃度を探す際には、できるだけ低い濃度を設定してください。また適切なブロッキング・バッファーおよび蛍光標識抗体の反応溶液を探してください。

11. 一度使用した二次抗体を繰り返し使用する事はできますか?

ウエスタン・ブロッティングでメンブレンとの反応に使用した蛍光標識抗体などは、回収して繰り返し使用することもありますが、正確な実験結果を得るにはお勧めしません。

12. ネガティブ・コントロールには何を使用すればいいですか?

蛍光標識抗体のみをサンプルと反応させてください (一次抗体は使用しません)。

13. Alexa Fluor® 標識抗体は多重染色に使用できますか?

色調が離れた色素の標識抗体であれは可能です。アブカムの Alexa Fluor® 標識二次抗体は、多重染色における選択に十分な9 種類もの色素を取り揃えています。

Alexa Fluor®色調*最大励起波長 (nm)最大蛍光波長 (nm)蛍光色**同様の蛍光波長を有する色素
405Colorless402421BlueCascade Blue
488Yellow495519GreenCy2, FITC (fluorescein)
555Pink555565OrangeCy3, TRITC (Rhodamine)
568Violet578603Orange / RedRhodamine Red
594Purple590617RedTexas Red
647Blue650668Far RedAPC, Cy5
680Blue679702Near-IR***Cy5.5, IR680
750Cyan749775Near-IR***Cy7
790Cyan784814Near-IR***IR800
* 容器中の色素 (標識抗体) が示す色調  ** 励起された色素が示す色調  *** 可視光として観察することはできません

14. Alexa Fluor® 標識二次抗体を用いて多重染色を行う場合、どのような蛍光標識を選べばいいですか?

多重染色を行う場合、Alexa Fluor® の最大蛍光波長が十分に離れているもの (最低でも 40 nm) を選択してください。選択に当たっては上記表または下記スペクトルをご参照ください。

例えば次のような組み合わせが有効です。

二重染色: 488 / 647
三重染色: 405 / 555 / 647

15. 多重染色を行う場合に抗体の交差反応を抑えるには、どのようにしたらいいですか?

二種類の一次抗体を用いて多重染色を行う場合には、一次抗体の由来動物種は異なる必要があります (マウス抗体とウサギ抗体など)。同じ動物種の一次抗体であっても、異なるアイソタイプの抗体 (マウス IgG1 とマウス IgM など) であれば使用できます。その場合の二次抗体は当然、異なるアイソタイプに対する抗体を使用する必要があります (抗マウス IgG1 と抗マウス IgM など)。アブカムは、多様な動物種とアイソタイプに対する二次抗体を取り揃えています。Alexa Fluor® 標識二次抗を探すにはこちらの早見表が便利です。マルチカラー・イメージングで交差反応を抑えるには、吸着処理済抗体を用いるのも有効です (次項参照)。

16. 吸着処理済抗体とはどのようなものですか?

吸着とは、抗体を予め交差反応を示す可能性のある動物の血清と反応させ、その成分を取り除く処理です。そうした処理を行った製品を 「Pre-adsorbed (吸着処理済)」 といい、交差反応の影響を減らすために有用です。より詳しくはこちらをご覧ください。アブカムは多様な吸着処理済製品を取り揃えています。吸着処理済標識二次抗体を探すにはこちらの早見表が便利です。

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選び方

1. 適切な保存温度を教えてください。

2. なぜ分注して保存すべきなのですか?

3. 保存に適した容器はどのようなものですか?

4. 抗体を希釈した上で保存することはできますか?

5. ブロッキング・バッファーにはどのような溶液を推奨しますか?

6. 抗原抗体反応の溶液は、どのようなものを使用したらいいですか?

7. 光は実験に影響を与えますか?

8. 蛍光標識抗体の反応に適した温度はありますか?また反応時間はどれくらいが適当ですか?

9. 蛍光標識抗体の希釈濃度はどのくらいが適当ですか?

10. バックグラウンドを低くするためにはどうすればいいですか?

11. 一度使用した二次抗体を繰り返し使用する事はできますか?

12. ネガティブ・コントロールには何を使用すればいいですか?

13. Alexa Fluor® 標識抗体は多重染色に使用できますか?

14. Alexa Fluor® 標識抗体を用いて多重染色を行う場合、どのような蛍光標識を選べばいいですか?

15. 多重染色を行う場合に抗体の交差反応を抑えるには、どのようにしたらいいですか?

16. 吸着処理済抗体とはどのようなものですか?

1. 適切な保存温度を教えてください。

1-2 週間程度であれば 4 ℃ です。それ以上の長期に保存する場合には分注した上で、-20 ℃ または -80 ℃ です。

2. なぜ分注して保存すべきなのですか?

コンタミの危険性を回避し、また凍結融解を繰り返すことによる力価の低下を防ぐためです。ただし溶液の蒸発や抗体タンパク質の溶液への吸着を避けるため、分注する容量は 10 μl 以上にしてください。

3. 保存に適した容器はどのようなものですか?

タンパク質の吸着が低い素材で、かつ遮光ができる容器を選んでください (蛍光色素は光に曝されると退色する恐れがあるため)。遮光ができる容器がない場合には、容器の外側をアルミホイルなどで覆ってください。

4. 抗体を希釈した上で保存することはできますか?

タンパク質は濃度が低くなるほど安定性が低下するのでお勧めしません。もしどうしても希釈した上で保存したい場合には、0.02% アジ化ナトリウム、1% BSA、および 30% グリセロールを含む PBS で希釈してください。

5. ブロッキング・バッファーにはどのような溶液を推奨しますか?

製品のデータシートに組成が記載されている場合には、それに従ってください。記載されていない場合には、ウエスタン・ブロッティングでは 5 % BSA または 5 % スキムミルクを、免疫蛍光染色および免疫細胞染色では二次抗体の動物種由来の血清 10 % を含む溶液、または 1 % BSA、または 1 % ゼラチンを、それぞれお勧めします。なおブロッキング・バッファーは、実験ごとに用事調製してください (作り置きはしないでください)。また、ブロッキング・バッファーの成分は、必ず完全に溶解させてください。望ましくはフィルターを通し、不溶物を完全に除去してください。

6. 抗原抗体反応の溶液は、どのようなものを使用したらいいですか?

バックグラウンドを低く抑えるためにブロッキング・バッファー (上記参照) または TBST (界面活性剤 Tween-20 を含むトリス緩衝食塩液 TBS) を用いてください。バックグラウンドに問題がない場合は、TBS または PBS (リン酸緩衝食塩液) で希釈したブロッキング・バッファーも使用できます。

7. 光は実験に影響を与えますか?

蛍光色素は一般に、光に曝されると蛍光強度が低下します (退色します)。Alexa Fluor® は比較的光の影響を受けにくい蛍光色素ではありますが、それでも光の暴露を避けるのに越したことはありません。蛍光標識抗体の反応中はアルミホイル等で遮光してください。

8. 蛍光標識抗体の反応に適した温度はありますか?また反応時間はどれくらいが適当ですか?

ウエスタン・ブロッティングや免疫蛍光染色/免疫細胞染色では室温 1 時間が目安です。サンプル中の抗原量が少ない場合や抗体の親和性が低い場合には、室温数時間、4℃ 一晩、といった条件も試してみてください。

9. 蛍光標識抗体の希釈濃度はどのくらいが適当ですか?

最適な希釈濃度は、実験条件、抗体の力価、サンプル中の抗原濃度など多くの要素で変わります。何点か段階希釈し、最適な濃度を探してください。最初は一次抗体濃度の 10 倍程度の希釈を試してみることをお勧めします。

10. バックグラウンドを低くするためにはどうすればいいですか?

蛍光標識抗体の希釈濃度を探す際には、できるだけ低い濃度を設定してください。また適切なブロッキング・バッファーおよび蛍光標識抗体の反応溶液を探してください。

11. 一度使用した二次抗体を繰り返し使用する事はできますか?

ウエスタン・ブロッティングでメンブレンとの反応に使用した蛍光標識抗体などは、回収して繰り返し使用することもありますが、正確な実験結果を得るにはお勧めしません。

12. ネガティブ・コントロールには何を使用すればいいですか?

蛍光標識抗体のみをサンプルと反応させてください (一次抗体は使用しません)。

13. Alexa Fluor® 標識抗体は多重染色に使用できますか?

色調が離れた色素の標識抗体であれは可能です。アブカムの Alexa Fluor® 標識二次抗体は、多重染色における選択に十分な9 種類もの色素を取り揃えています。

Alexa Fluor®色調*最大励起波長 (nm)最大蛍光波長 (nm)蛍光色**同様の蛍光波長を有する色素
405Colorless402421BlueCascade Blue
488Yellow495519GreenCy2, FITC (fluorescein)
555Pink555565OrangeCy3, TRITC (Rhodamine)
568Violet578603Orange / RedRhodamine Red
594Purple590617RedTexas Red
647Blue650668Far RedAPC, Cy5
680Blue679702Near-IR***Cy5.5, IR680
750Cyan749775Near-IR***Cy7
790Cyan784814Near-IR***IR800
* 容器中の色素 (標識抗体) が示す色調  ** 励起された色素が示す色調  *** 可視光として観察することはできません

14. Alexa Fluor® 標識二次抗体を用いて多重染色を行う場合、どのような蛍光標識を選べばいいですか?

多重染色を行う場合、Alexa Fluor® の最大蛍光波長が十分に離れているもの (最低でも 40 nm) を選択してください。選択に当たっては上記表または下記スペクトルをご参照ください。

例えば次のような組み合わせが有効です。

二重染色: 488 / 647
三重染色: 405 / 555 / 647

15. 多重染色を行う場合に抗体の交差反応を抑えるには、どのようにしたらいいですか?

二種類の一次抗体を用いて多重染色を行う場合には、一次抗体の由来動物種は異なる必要があります (マウス抗体とウサギ抗体など)。同じ動物種の一次抗体であっても、異なるアイソタイプの抗体 (マウス IgG1 とマウス IgM など) であれば使用できます。その場合の二次抗体は当然、異なるアイソタイプに対する抗体を使用する必要があります (抗マウス IgG1 と抗マウス IgM など)。アブカムは、多様な動物種とアイソタイプに対する二次抗体を取り揃えています。Alexa Fluor® 標識二次抗を探すにはこちらの早見表が便利です。マルチカラー・イメージングで交差反応を抑えるには、吸着処理済抗体を用いるのも有効です (次項参照)。

16. 吸着処理済抗体とはどのようなものですか?

吸着とは、抗体を予め交差反応を示す可能性のある動物の血清と反応させ、その成分を取り除く処理です。そうした処理を行った製品を 「Pre-adsorbed (吸着処理済)」 といい、交差反応の影響を減らすために有用です。より詳しくはこちらをご覧ください。アブカムは多様な吸着処理済製品を取り揃えています。吸着処理済標識二次抗体を探すにはこちらの早見表が便利です。

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