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免疫組織染色がうまくいく 10 のポイント

免疫組織染色(Immunohistochemistry; IHC)を成功させるための、10 のポイントをご紹介します。

1. 試料の調製

免疫組織染色においては、試料の調製法が組織形態と抗原構造の維持を左右するため、その選択は非常に重要です。調製法としてはパラフィン包埋、凍結、そしてそれほど一般的ではありませんがレジン包埋があります。パラフィン包埋の利点は、凍結よりも組織の形態を細部まで保持できること、そして保存が便利なことです。凍結の利点の一つはパラフィン包埋よりも調製の時間が短いことで、迅速性が要求されるバイオプシー(生体組織検査)においては圧倒的に有利です。凍結のもう一つの利点は、パラフィン包埋よりもエピトープの構造や酵素活性がよく保持されていることで、後述の抗原賦活化の処理が必要ない、in situ での活性検出がしやすい、といった点で有利です。

2. ホルムアルデヒドによる固定と抗原賦活化

パラフィン包埋から切り出された切片(パラフィン切片)では常に、凍結切片では必要に応じて、固定の操作が必要となります。固定には、酢酸などの酸を用いる方法、メタノールやアセトンなどの有機溶媒を用いる方法、ホルマリンやパラホルムアルデヒド(PFA)など、ホルムアルデヒドをベースとした固定剤を用いる方法があります。固定法の選択は、その後の染色をうまく行うための重要なポイントです。パラフィン包埋において一般的に用いられる、ホルムアルデヒドをベースとした固定剤は、エピトープの分子構造を化学的に修飾します。それによって抗原が、抗体が近づきにくい、いわば覆われたような状態になってしまうことがあります。抗原賦活化(Antigen retrieval)とは、その覆われた抗原を再び露出させることを言います。具体的な方法としては、加熱処理と酵素処理の二つがあります。免疫組織染色を試したことのない抗体で、かつデータシートなどに具体的な抗原賦活化法の情報がない場合には、まずは加熱処理(熱誘導でエピトープを回復させる HIER と呼ばれる方法も含む)を試してみることをお勧めします。酵素処理とは文字通り酵素で処理することで、用いる酵素は主に、Trypsin、Proteinase K、Pronase などのタンパク質分解酵素です。

3. スライドへの組織の接着:電荷

接着が弱いために、染色の過程で切片がスライドから剥離したり、その切片が傷ついたりたりすることがあります。剥離の発生を避けるには、切片をのせた後十分に水分を除くことが大切です(次項目 4. 参照)。また正電荷を帯びたスライドグラスを使用するのも有効です。組織切片のタンパク質は負の電荷を帯びていることが多いからです。正電荷を帯びたスライドグラスとしては、通常のスライドグラスを各種試薬(ポリ-L-リジン、APES(3-アミノプロピルトリエトキシシラン)など)でコーティングするか、市販の正電荷付与済みスライドグラスを使用してください。

4. スライドへの組織の接着:脱水

パラフィン切片でも凍結切片でも、切片とスライドとの間には水分が残ります。スライドと組織の間の分子間相互作用を最大限にして接着を強くするため、また続く染色過程における悪影響を抑えるため、この水分はできるだけ取り除いてください。パラフィン切片の場合は、キシレンやエタノールで脱パラフィンする前に、56℃ の乾いたインキュベーター内で少なくとも 30 分は乾燥させて下さい。切片とスライドの間隙からの水分の排水を促すため、乾燥はスライドを垂直に立てて行います。凍結切片の場合は、薄片にした後少なくとも 30 分室温で乾燥させ、その後アセトン、メタノールなどの固定剤で固定し、さらに再度乾燥させます。凍結切片をパラホルムアルデヒドやホルマリンで固定した場合は、固定後の乾燥は必要ありません(そのまま染色のステップに進みます)。

5. 組織のポジティブコントロール

ある抗体を免疫組織染色で初めて用いる場合には、まずは目的の抗原が存在することが明らかな組織切片を用いて試してみることをお勧めします。免疫組織染色で使用できることが確認済みの抗体と、一緒に操作を行うことができれば、なお確実です(うまくいかなかった場合のトラブルシューティングがしやすいため)。

6. 抗体のネガティブコントロール

得られた染色像が特異的な反応によるものである(言いかえれば、一次抗体あるいは二次抗体の非特異的結合によるものではない)ということを証明するためには、ネガティブ・コントロールとしてアイソタイプ・コントロールを用いた実験が必要です。一次抗体を含まない反応液か、または一次抗体をアイソタイプ・コントロール(一次抗体と同じアイソタイプでかつ試料と絶対に特異的に反応しない抗体 (抗 KLH、抗 DNP など))に置き換えた反応液を用い、同じ条件で操作を行い判定してください。一次抗体として未精製の抗血清を使用している場合、ネガティブ・コントロールは、免疫していていない同じ動物種の未精製血清を用いてください。

アイソタイプ・コントロールにつきましては、二次抗体 FAQ のページの「一次抗体のアイソタイプ(Isotype)とは何ですか?」の項もご参照ください。またアイソタイプ・コントロールの選択につきましては、FAQ ページの「アイソタイプ・コントロールはどのように選択すればいいですか?」の項もご参照ください。

7. エピトープへの非特異的結合のブロッキング

高いバックグランウンドや偽陽性が認められる場合、抗体とタンパク質の非特異的結合のブロッキングが不十分であることがまず考えられます。二次抗体の免疫動物と同種の 5-10% 正常血清(非免疫動物の血清)を使用してください(一次抗体が直接標識されている場合には、一次抗体の免疫動物と同種の正常血清)。BSA やカゼイン、スキムミルクを含むブロッキング試薬も有用です。またアブカムの Background Reducing Buffer(ab64234)もご検討下さい。

不十分なブロッキング以外の原因としては下記も考えられます。

  1. 組織内の疎水性タンパク質への抗体の非特異的な会合
  2. 組織内の Fc レセプターへの抗体の結合
  3. 内因性ペルオキシダーゼによる発色
  4. 内在性ビオチンによる反応
  5. 自家蛍光による発光

このような場合には、内在性物質の失活化など特別な処理が必要となります。詳細はメールでお問い合わせください。4 についてはビオチンを用いない EXPOSE kit を用いるか、あるいは Endogenous Avidin + Biotin Blocking System (ab3387) をご検討下さい。

8. マウス・オン・マウス染色

マウス由来の一次抗体(マウス・モノクローナル抗体など)をマウスの組織に使用する場合、一次抗体のマウス・イムノグロブリンを検出する二次抗体が組織の内因性のイムノグロブリンに反応し、バックグラウンドが高くなる場合があります。これを最小限に抑える方法がいくつかあります。

  1. 一次抗体として、マウス由来ではないものを選択する: ウサギ・モノクローナル抗体 RabMab をお勧めします。
  2. 標識二次抗体ではなく、直接標識一次抗体を使用する:アブカムは酵素や蛍光色素などを一次抗体に直接標識製品を多数ラインアップしています。こちらをご覧ください。直接標識抗体が市販されていない場合には、Abcam Antibody Conjugation Kits などの標識キットをご利用ください。
  3. バックグラウンドを低下させるキット製品を使用する:アブカムの Mouse on Mouse IHC キットをお勧めします。
  4. F(ab) フラグメント二次抗体を利用する:方法は以下をご参照ください。1. 組織切片を通常どおり調製する。2. 二次抗体と同じ動物種由来の血清によるブロッキングを、30 分行った後、PBS-T(Tween20/PBS)または TBS-T(Tween20/TBS)で 2 分間の洗浄を 3 回行う。3. Fab フラグメントの抗マウス・イムノグロブリン抗体(Goat Fab Anti-Mouse IgG H+L(ab6668)など)を、室温で 1 時間、または 4 ℃ で一晩反応させる。濃度は 0.1 mg/ml を基本とするが、サンプルごとに最適な濃度を検討することが望ましい。4. 洗浄し、通常の免疫組織染色のステップに進む。
  5. 一次抗体と同じアイソタイプのイムノグロブリン以外を吸着処理した上で、一次抗体と同じアイソタイプに特異的な標識二次抗体を用いる: 方法は以下をご参照ください。Cattoretti G, Qing Fei. Application of the Antigen Retrieval Technique in experimental Pathology: from human to mouse. In Antigen Retrieval Techniques. Shi SR, Gy J and Taylor CR Editors. Eaton Publishing, Natick MA 2000. pp. 165-179.
  6. 一次抗体と二次抗体をプレ・インキュべートする: 方法は以下をご参照ください。Modified indirect immunodetection allows study of murine tissue with mouse monoclonal antibodies. J Histochem Cytochem. 1994 Nov;42(11):1499-502. PMID: 7930532. Finally, various "mouse-on-mouse" staining kits are available commercially.

9. 抗体の濃度

ある抗体を免疫組織染色で初めて用いる場合、一次抗体の濃度や希釈率については、まずは製品のデータシートで推奨濃度・希釈率をお試しください。推奨濃度・希釈率の記載がない場合、1.0 μg/ml 付近(未精製抗体の場合それに相当する希釈率)から検討をスタートして下さい。抗体の至適濃度を決定する要因は複数あります。

  1. 組織における目的抗原タンパク質の発現量
  2. 固定のされ方
  3. 賦活化の効果
  4. 蛍光法、酵素抗体法、増幅法 (ABC法 (アビジン?ビオチン複合体)、ポリマー法、EXPOSE kit)など。

一次抗体の至適濃度を検討する場合、複数の抗体濃度(希釈率)のポイントについて同時に染色を行うことをお勧めします。例えば、濃度なら 0.5 μg/ml、2 μg/ml、8 μg/ml、希釈率なら 1/50、1/200、1/800 というようにポイントを取ります。得られた像の中から最も明瞭で、バックグラウンドの低い抗体濃度・希釈率を選んでください。

抗体の使用濃度につきましては、FAQ ページの「一次抗体はどれくらいの濃度で使用すればいいですか?」の項もご参照ください。

10. インターネット上の情報

インターネット上には、アブカムの FAQ のページやプロトコールのページを始めとして、免疫組織染色に関する情報が数多くあります。ご活用ください。

免疫組織染色関連リンク


FAQ

トラブル
シューティング

RabMAb 標準
プロトコール

多重染色キット

対比染色・
特殊染色キット

IHC リソース

免疫組織染色(Immunohistochemistry; IHC)を成功させるための、10 のポイントをご紹介します。

1. 試料の調製

免疫組織染色においては、試料の調製法が組織形態と抗原構造の維持を左右するため、その選択は非常に重要です。調製法としてはパラフィン包埋、凍結、そしてそれほど一般的ではありませんがレジン包埋があります。パラフィン包埋の利点は、凍結よりも組織の形態を細部まで保持できること、そして保存が便利なことです。凍結の利点の一つはパラフィン包埋よりも調製の時間が短いことで、迅速性が要求されるバイオプシー(生体組織検査)においては圧倒的に有利です。凍結のもう一つの利点は、パラフィン包埋よりもエピトープの構造や酵素活性がよく保持されていることで、後述の抗原賦活化の処理が必要ない、in situ での活性検出がしやすい、といった点で有利です。

2. ホルムアルデヒドによる固定と抗原賦活化

パラフィン包埋から切り出された切片(パラフィン切片)では常に、凍結切片では必要に応じて、固定の操作が必要となります。固定には、酢酸などの酸を用いる方法、メタノールやアセトンなどの有機溶媒を用いる方法、ホルマリンやパラホルムアルデヒド(PFA)など、ホルムアルデヒドをベースとした固定剤を用いる方法があります。固定法の選択は、その後の染色をうまく行うための重要なポイントです。パラフィン包埋において一般的に用いられる、ホルムアルデヒドをベースとした固定剤は、エピトープの分子構造を化学的に修飾します。それによって抗原が、抗体が近づきにくい、いわば覆われたような状態になってしまうことがあります。抗原賦活化(Antigen retrieval)とは、その覆われた抗原を再び露出させることを言います。具体的な方法としては、加熱処理と酵素処理の二つがあります。免疫組織染色を試したことのない抗体で、かつデータシートなどに具体的な抗原賦活化法の情報がない場合には、まずは加熱処理(熱誘導でエピトープを回復させる HIER と呼ばれる方法も含む)を試してみることをお勧めします。酵素処理とは文字通り酵素で処理することで、用いる酵素は主に、Trypsin、Proteinase K、Pronase などのタンパク質分解酵素です。

3. スライドへの組織の接着:電荷

接着が弱いために、染色の過程で切片がスライドから剥離したり、その切片が傷ついたりたりすることがあります。剥離の発生を避けるには、切片をのせた後十分に水分を除くことが大切です(次項目 4. 参照)。また正電荷を帯びたスライドグラスを使用するのも有効です。組織切片のタンパク質は負の電荷を帯びていることが多いからです。正電荷を帯びたスライドグラスとしては、通常のスライドグラスを各種試薬(ポリ-L-リジン、APES(3-アミノプロピルトリエトキシシラン)など)でコーティングするか、市販の正電荷付与済みスライドグラスを使用してください。

4. スライドへの組織の接着:脱水

パラフィン切片でも凍結切片でも、切片とスライドとの間には水分が残ります。スライドと組織の間の分子間相互作用を最大限にして接着を強くするため、また続く染色過程における悪影響を抑えるため、この水分はできるだけ取り除いてください。パラフィン切片の場合は、キシレンやエタノールで脱パラフィンする前に、56℃ の乾いたインキュベーター内で少なくとも 30 分は乾燥させて下さい。切片とスライドの間隙からの水分の排水を促すため、乾燥はスライドを垂直に立てて行います。凍結切片の場合は、薄片にした後少なくとも 30 分室温で乾燥させ、その後アセトン、メタノールなどの固定剤で固定し、さらに再度乾燥させます。凍結切片をパラホルムアルデヒドやホルマリンで固定した場合は、固定後の乾燥は必要ありません(そのまま染色のステップに進みます)。

5. 組織のポジティブコントロール

ある抗体を免疫組織染色で初めて用いる場合には、まずは目的の抗原が存在することが明らかな組織切片を用いて試してみることをお勧めします。免疫組織染色で使用できることが確認済みの抗体と、一緒に操作を行うことができれば、なお確実です(うまくいかなかった場合のトラブルシューティングがしやすいため)。

6. 抗体のネガティブコントロール

得られた染色像が特異的な反応によるものである(言いかえれば、一次抗体あるいは二次抗体の非特異的結合によるものではない)ということを証明するためには、ネガティブ・コントロールとしてアイソタイプ・コントロールを用いた実験が必要です。一次抗体を含まない反応液か、または一次抗体をアイソタイプ・コントロール(一次抗体と同じアイソタイプでかつ試料と絶対に特異的に反応しない抗体 (抗 KLH、抗 DNP など))に置き換えた反応液を用い、同じ条件で操作を行い判定してください。一次抗体として未精製の抗血清を使用している場合、ネガティブ・コントロールは、免疫していていない同じ動物種の未精製血清を用いてください。

アイソタイプ・コントロールにつきましては、二次抗体 FAQ のページの「一次抗体のアイソタイプ(Isotype)とは何ですか?」の項もご参照ください。またアイソタイプ・コントロールの選択につきましては、FAQ ページの「アイソタイプ・コントロールはどのように選択すればいいですか?」の項もご参照ください。

7. エピトープへの非特異的結合のブロッキング

高いバックグランウンドや偽陽性が認められる場合、抗体とタンパク質の非特異的結合のブロッキングが不十分であることがまず考えられます。二次抗体の免疫動物と同種の 5-10% 正常血清(非免疫動物の血清)を使用してください(一次抗体が直接標識されている場合には、一次抗体の免疫動物と同種の正常血清)。BSA やカゼイン、スキムミルクを含むブロッキング試薬も有用です。またアブカムの Background Reducing Buffer(ab64234)もご検討下さい。

不十分なブロッキング以外の原因としては下記も考えられます。

  1. 組織内の疎水性タンパク質への抗体の非特異的な会合
  2. 組織内の Fc レセプターへの抗体の結合
  3. 内因性ペルオキシダーゼによる発色
  4. 内在性ビオチンによる反応
  5. 自家蛍光による発光

このような場合には、内在性物質の失活化など特別な処理が必要となります。詳細はメールでお問い合わせください。4 についてはビオチンを用いない EXPOSE kit を用いるか、あるいは Endogenous Avidin + Biotin Blocking System (ab3387) をご検討下さい。

8. マウス・オン・マウス染色

マウス由来の一次抗体(マウス・モノクローナル抗体など)をマウスの組織に使用する場合、一次抗体のマウス・イムノグロブリンを検出する二次抗体が組織の内因性のイムノグロブリンに反応し、バックグラウンドが高くなる場合があります。これを最小限に抑える方法がいくつかあります。

  1. 一次抗体として、マウス由来ではないものを選択する: ウサギ・モノクローナル抗体 RabMab をお勧めします。
  2. 標識二次抗体ではなく、直接標識一次抗体を使用する:アブカムは酵素や蛍光色素などを一次抗体に直接標識製品を多数ラインアップしています。こちらをご覧ください。直接標識抗体が市販されていない場合には、Abcam Antibody Conjugation Kits などの標識キットをご利用ください。
  3. バックグラウンドを低下させるキット製品を使用する:アブカムの Mouse on Mouse IHC キットをお勧めします。
  4. F(ab) フラグメント二次抗体を利用する:方法は以下をご参照ください。1. 組織切片を通常どおり調製する。2. 二次抗体と同じ動物種由来の血清によるブロッキングを、30 分行った後、PBS-T(Tween20/PBS)または TBS-T(Tween20/TBS)で 2 分間の洗浄を 3 回行う。3. Fab フラグメントの抗マウス・イムノグロブリン抗体(Goat Fab Anti-Mouse IgG H+L(ab6668)など)を、室温で 1 時間、または 4 ℃ で一晩反応させる。濃度は 0.1 mg/ml を基本とするが、サンプルごとに最適な濃度を検討することが望ましい。4. 洗浄し、通常の免疫組織染色のステップに進む。
  5. 一次抗体と同じアイソタイプのイムノグロブリン以外を吸着処理した上で、一次抗体と同じアイソタイプに特異的な標識二次抗体を用いる: 方法は以下をご参照ください。Cattoretti G, Qing Fei. Application of the Antigen Retrieval Technique in experimental Pathology: from human to mouse. In Antigen Retrieval Techniques. Shi SR, Gy J and Taylor CR Editors. Eaton Publishing, Natick MA 2000. pp. 165-179.
  6. 一次抗体と二次抗体をプレ・インキュべートする: 方法は以下をご参照ください。Modified indirect immunodetection allows study of murine tissue with mouse monoclonal antibodies. J Histochem Cytochem. 1994 Nov;42(11):1499-502. PMID: 7930532. Finally, various "mouse-on-mouse" staining kits are available commercially.

9. 抗体の濃度

ある抗体を免疫組織染色で初めて用いる場合、一次抗体の濃度や希釈率については、まずは製品のデータシートで推奨濃度・希釈率をお試しください。推奨濃度・希釈率の記載がない場合、1.0 μg/ml 付近(未精製抗体の場合それに相当する希釈率)から検討をスタートして下さい。抗体の至適濃度を決定する要因は複数あります。

  1. 組織における目的抗原タンパク質の発現量
  2. 固定のされ方
  3. 賦活化の効果
  4. 蛍光法、酵素抗体法、増幅法 (ABC法 (アビジン?ビオチン複合体)、ポリマー法、EXPOSE kit)など。

一次抗体の至適濃度を検討する場合、複数の抗体濃度(希釈率)のポイントについて同時に染色を行うことをお勧めします。例えば、濃度なら 0.5 μg/ml、2 μg/ml、8 μg/ml、希釈率なら 1/50、1/200、1/800 というようにポイントを取ります。得られた像の中から最も明瞭で、バックグラウンドの低い抗体濃度・希釈率を選んでください。

抗体の使用濃度につきましては、FAQ ページの「一次抗体はどれくらいの濃度で使用すればいいですか?」の項もご参照ください。

10. インターネット上の情報

インターネット上には、アブカムの FAQ のページやプロトコールのページを始めとして、免疫組織染色に関する情報が数多くあります。ご活用ください。

免疫組織染色関連リンク


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トラブル
シューティング

RabMAb 標準
プロトコール

多重染色キット

対比染色・
特殊染色キット

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