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蛍光顕微鏡やフローサイトメーターの性能と操作性が向上することにより、誰でも複数の蛍光色素を駆使し、自由自在に多重染色を行い、また解析することが可能となってきました。この多重染色を行なう利点としては、次のようなことが挙げられます。
多重染色には直接法と間接法があります。
直接法:蛍光を直接標識した一次抗体を複数使用します(標識二次抗体は使用しません)。二次抗体による交差反応を避けることができ、また系が簡単で操作時間が短いといった特長があります。
間接法:一次抗体を複数使用し、それら一次抗体に対する標識二次抗体を使用します。増幅法の併用などにより、直接法よりも高い感度で検出できます。ここでは間接法において、美しい画像と正確な結果を得るためのコツを述べます。
標識二次抗体を用いた多重染色を行なうに場合には、ホスト動物種が異なる複数の一次抗体を使用する必要があります。しかしながらそのような抗体を入手できない場合もあります(二種類のターゲットに対する一次抗体が共にマウス・モノクローナル抗体しかない場合など)。そのような場合は以下 2 つの方法をお試しください。ただしどちらの方法を用いたとしても、ホスト動物種が異なる一次抗体を使用した場合よりも、交差反応のリスクは高まることにご留意ください。
多重染色において使用する蛍光色素を選択するに当たっては、励起波長および蛍光波長の蛍光スペクトルを考慮しなくてはなりません。アブカムは可視光領域をカバーする 9 種類の Alexa Fluor® 蛍光色素を標識した二次抗体を取り揃えており、組み合わせがしやすいラインアップになっています。下に各蛍光色素同士の適合性をまとめました。
緑(High) > 橙(Medium) > 赤(Low)の順で適合性が高くなります。緑(High)の組み合わせでは蛍光スペクトルの重なりがほとんどなく、問題なく組み合わせができます。橙(Medium)や赤(Low)の組み合わせでは蛍光スペクトルの重なりがあるため、多重染色で同時に使用することはお勧めしません。
Alexa Fluor® はバックグラウンドの低さ、蛍光強度の強さ、そして退色のしにくさで定評のある蛍光色素です。アブカムのAlexa Fluor® 蛍光標識済み二次抗体には以下の特長があります。
Alexa Fluor® 蛍光標識済み二次抗体を用いた二重染色の例:
画像:Shaohua Li 博士(UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School)提供
サンプル:マウス ES 細胞より分化した胚様体(Embryoid body: EB)対比染色:DAPI により核を染色(青色)
抗体 | ターゲット A – ラミニン | ターゲット B – Ki67 |
一次抗体 | ラミニン α1 ウサギ・ポリクローナル抗体 | Ki67 マウス・モノクローナル抗体 |
二次抗体 | Alexa Fluor® 594 標識抗ウサギ IgG H&L ヤギ二次抗体 - 血清吸着処理済み(ab150084) 吸着処理血清動物種:Human、Mouse、Rat | Alexa Fluor® 488 標識抗マウス IgG H&L ヤギ二次抗体 -血清吸着処理済み(ab150117) 吸着処理血清動物種:Chicken、Cow、Horse、Human、Pig、Rabbit、Rat |
ポイント:この例では、2 種類の二次抗体はどちらもヤギ抗体なので、お互いには反応しません。また血清吸着処理済み製品なので、ターゲット以外の一次抗体や、マウス組織に含有される可能性のある内在性イムノグロブリンとは反応しません。
Alexa Fluor® is a registered trademark of Life Technologies. Alexa Fluor® dye conjugates contain(s) technology licensed to Abcam by Life Technologies.