All tags primary-antibodies 細胞増殖研究ガイド

細胞増殖研究ガイド

細胞増殖の検出、カウント、解析に必要な技術と実験ツール

培養細胞や組織における増殖細胞の検出は、化合物の毒性や腫瘍の予後を判別・予測する際などで、広く行なわれます。その増殖細胞の検出に用いられる方法としては、DNA 合成(DNA に取り込まれたプローブ)の検出、細胞代謝能の測定、増殖細胞マーカー・タンパク質の検出などがあります。


DNA 合成の検出

  • BrdU
  • IdU および CldU
  • EdU


細胞代謝能の測定

  • MTT
  • XTT
  • WST-1


増殖細胞マーカー・タンパク質の検出

  • PCNA
  • Ki67
  • MCM-2


増殖細胞のカウント


増殖細胞の検出ツール

DNA 合成の検出における代表的なプローブは BrdU(5 – ブロモ - 2' - デオキシウリジン)ですが、経時変化を観察する場合には IdU/CldU(5 - ヨード - 2' - デオキシウリジン/5 – クロロ - 2' - デオキシウリジン)が、生細胞を用いる場合には EdU(5 - エチニル - 2' - デオキシウリジン)が、それぞれ適しています。

細胞代謝能の測定で最も一般的な手法は MTT(Thiazolyl blue tetrazolium bromide)ですが、この他に XTT、WST-1 などがあり、感度などの特性が異なります。

増殖細胞マーカー・タンパク質の代表である Ki67 を抗体で検出する方法は、基礎研究と臨床研究、どちらの分野においても豊富な実績があり、確立されていますが、実験の目的によっては PCNA や MCM-2 に対する抗体も使用されます。


種類

マーカー

特性とメリット

デメリット

おすすめ製品

DNA 合成

BrdU

G1 期、S 期、G2/M 期それぞれにいる細胞の割合や、細胞周期の動態を検出するのに有用。

抗体での検出には DNase、熱、酸などによる DNA 変性処理が必要。

DNA 変性処理により DNA や他の抗原の構造を壊す場合があり、他のターゲットとの多重染色には適さない。

BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) (ab142567)

Anti-BrdU antibody [BU1/75 (ICR1)] (ab6326)

Anti-BrdU antibody - Proliferation Marker (ab1893)

IdU および

 CldU

DNA 複製フォークの進行速度、安定性、複製起点の点火の研究に有用。

二種類のプローブを同時に用いることで、経時変化の観察など複雑な研究が可能。

抗体での検出には DNase、熱、酸などによる DNA 変性処理が必要。

DNA 変性処理により DNA や他の抗原の構造を壊す場合があり、他のターゲットとの多重染色には適さない。


Idoxuridine (ab142581)

Anti-BrdU antibody [BU1/75 (ICR1)] (ab6326)

Anti-IdU antibody [32D8.D9] (ab181664)

EdU

G1 期、S 期、G2/M 期それぞれにいる細胞の割合や、細胞周期の動態を検出するのに有用。

抗体による検出とそれに伴う変性処理が必要なく、よりシンプルなプロトコール。

値段が高い。

5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (5-EdU) (ab146186)

BDP FL alkyne (ab146583)


細胞代謝能

MTT

細胞呼吸を定量測定し、間接的に増殖細胞を検出

シンプルなプロトコール

細胞増殖を直接測定しているわけはない。

細胞傷害性がある。

不溶性なので培地添加前に溶媒への溶解が必要。

エンドポイントでの測定のみ可能(経時変化を追うことはできない)。

Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) (ab146345)

XTT

細胞呼吸を定量測定し、間接的に増殖細胞を検出。

シンプルなプロトコール。

MTT より高感度。

細胞増殖を直接測定しているわけはない。

実験条件により感度が変わる。

XTT sodium salt (ab146310)

WST-1

細胞呼吸を定量測定し、間接的に増殖細胞を検出。

シンプルなプロトコール。

XTT よりさらに高感度。

細胞増殖を直接測定しているわけはない。

WST-1 Cell Proliferation Reagent (ready to use) (ab155902)

増殖細胞マーカータンパク質

PCNA

G1 後期および S 期にいる細胞の検出に有用。

一部腫瘍においては予後予測に有用。

結果の解釈が主観的になる可能性がある。

Ki67 に感度や特異性で劣る。

Anti-PCNA antibody [PC10] (ab29)

Ki67

G1 期、S 期、G2 期、M 期の細胞の検出に有用。

一部腫瘍においては予後予測に有用。

実績やデータが豊富。

結果の解釈が主観的になる可能性がある。

一部の腫瘍においては MCM-2 に感度や特異性で劣る。


Anti-Ki67 antibody (ab15580)

Anti-Ki67 antibody  [SP6] (ab16667)

MCM-2

G1 期、S 期、G2 期、M 期の細胞の検出に有用。

一部腫瘍においては予後予測に有用。

結果の解釈が主観的になる可能性がある。

Anti-MCM2 antibody (ab4461)

Anti-MCM2 antibody [EPR4120] (ab108935)


DNA 合成の検出

増殖細胞を検出するために最も確実な方法は、細胞の DNA 合成を検出することです。それには、DNA 合成が行なわれる際に DNA に取り込まれる(細胞・DNA をラベルする)、チミジン・アナログ(チミジン類似物質)などのプローブを細胞と共に培養し、取り込まれたプローブを検出する方法があります。

プローブとして広く用いられているチミジン・アナログとしては、5 – ブロモ - 2' - デオキシウリジン(BrdU)があります。また、5 - ヨード - 2' - デオキシウリジン(IdU)、5 – クロロ - 2' - デオキシウリジン(CldU)、5 - エチニル - 2' - デオキシウリジン(EdU)といった化合物も使用されます。このようなチミジン・アナログは DNA 合成を行なう細胞に効率よく取り込まれますが、DNA へのダメージ、細胞の変異、細胞周期への影響などが起こることがありますので注意が必要です1,2。チミジン・アナログの検出は、抗体を用いた方法の他、プローブに標識された蛍光色素や RI などを直接検出する方法もあり、免疫組織染色(IHC)、免疫細胞染色(ICC)、ELISA、フローサイトメトリーなど、さまざまなアプリケーションで行なわれます。また、マルチプレックスに対応しているキットを用いれば、ハイスループットな検出も可能です。

チミジン・アナログを用いた DNA 合成検出の特徴には、次のようなものがあります。

  • 得られる結果が正確である。
  • ハイスループット、ロースループットのどちらの方法にも適応が可能である。
  • 比較的時間がかかる。
  • EdU を除き検出には DNA 変性処理が必要なため、他のターゲットとの多重染色には適さない。


BrdU

Immunohistochemistry (Formalin/PFA-fixed paraffin-embedded sections) - Anti-BrdU antibody - Proliferation Marker (ab1893)

BrdU を取り込ませた Ramos 細胞株移植組織 FFPE 切片を、BrdU 抗体(ab1893)を用いて免疫組織染色で検出。

  • DNA 合成時に取り込まれるチミジン・アナログ。
  • 増殖細胞および娘細胞をラベルする。
  • BrdU 抗体で検出する。
  • G1 期、S 期、G2/M 期それぞれにいる細胞の割合や、細胞周期の動態を検出するのに有用。
  • 抗体での検出には DNase、熱、酸などによる DNA 変性処理が必要。
  • DNA 変性処理により DNA や他の抗原の構造を壊す場合があり、他のターゲットとの多重染色には適さない。


IdU および CldU


Immunohistochemistry (Formalin/PFA-fixed paraffin-embedded sections) - Anti-IdU [2F8] antibody (ab187742)

IdU を取り込ませたマウス大腸組織の FFPE 切片を、IdU 抗体(ab187742)を用いて免疫組織染色で検出。

  • DNA 合成時に取り込まれるチミジン・アナログ。
  • 増殖細胞および娘細胞をラベルする。
  • 二種類のプローブを同時に用いることで、経時変化の観察が可能。
  • DNA 複製フォークの進行速度、安定性、複製起点の点火の研究に有用。
  • BrdU 抗体および IdU 抗体で検出する。
  • BrdU 抗体の、CldU への交差反応性と IdU に対する交差反応性は抗体の種類によって異なるため、BrdU と多重染色を行なう場合には注意が必要。
  • 抗体での検出には DNase、熱、酸などによる DNA 変性処理が必要。
  • DNA 変性処理により DNA や他の抗原の構造を壊す場合があり、他のターゲットとの多重染色には適さない。


EdU


DNA に取り込まれた BrdU を抗体で検出するには DNA 変性処理が必要だが(左)、DNA に取り込まれた EdU には蛍光色素を直接結合させることが可能(右; クリック・ケミストリー)。

  • DNA 合成時に取り込まれるチミジン・アナログ。
  • 増殖細胞および娘細胞をラベルする。
  • G1 期、S 期、G2/M 期それぞれにいる細胞の割合を検出するのに有用。
  • クリック・ケミストリーによる検出が可能。
  • エチニル基に Alexa Fluor® などの蛍光色素を直接標識することができ、膜透過性が高い。
  • 変性処理が不要であり、多重染色が可能。
  • 抗体による検出とそれに伴う変性処理が必要なく、よりシンプルなプロトコール。

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細胞代謝能の測定

テトラゾリウム塩で細胞の代謝活性を測定することにより、間接的に細胞増殖を計測することができます。テトラゾリウム塩は代謝活性が存在する環境で色素を形成します。その培地の色の変化を分光光度計で定量し、細胞増殖の指標とします。

感度が良い一方、通常の培地には不溶で、生成される色素も結晶化してしまうようなテトラゾリウム塩があり、その場合は毒性の心配がある DMSO やイソプロパノールなどの溶媒で溶解しなくてはなりません。ただし、現在では培地に可溶で、かつ毒性がないテトラゾリウム塩も知られています。


MTT

  • 2-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-3,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)
  • 細胞呼吸を定量測定し、間接的に増殖細胞を検出。
  • シンプルなプロトコール。
  • 生成されるホルマザン色素(紫)が培地に不溶なので、測定前に溶媒で溶解する必要がある。
  • 細胞傷害性がある。
  • エンドポイントでの測定のみ可能(経時変化を追うことはできない)。


XTT


  • 2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide (XTT)
  • 細胞呼吸を定量測定し、間接的に増殖細胞を検出。
  • シンプルなプロトコール。
  • 生成されるホルマザン色素(オレンジ)が培地に可溶なので、測定前に溶媒で溶解する必要がない。
  • MTT より高感度。
  • 実験条件により感度が変わる。


WST-1


  • Water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1)
  • 細胞呼吸を定量測定し、間接的に増殖細胞を検出。
  • 生成されるホルマザン色素(OD420–450 で測定可)が培地に可溶なので、測定前に溶媒で溶解する必要がない。
  • シンプルなプロトコール。
  • MTT や XTT より高感度。

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増殖細胞マーカー・タンパク質

増殖細胞の検出には、増殖細胞で特異的に発現し、非増殖細胞では存在しないタンパク質を検出するという方法もあります。このようなタンパク質は通、細胞周期の G0 期以外おいて核の内部あるいは周辺部に存在しており、そのタンパク質に特異的な抗体を用いて、免疫組織染色などで検出することができます。こうした用途で使用できるタンパク質として最も実績が豊富なのは Ki67 で、がんの診断や予後予測に有用であるとされ、病理診断のマーカーとして日常的に用いられています。PCNA もマーカーとしてよく利用されるタンパク質ですが、感度と特異性の点で Ki67 の方が優れているという報告が多いようです3-6。最近では、がんの予後予測に関して言えば Ki67 や PCNA よりも、MCM2 の方が優れていると主張する報告もあります7,8

しかしながらどのタンパク質が、細胞増殖を検出する上で最も優れているか、また臨床用のマーカーとして最も有用か、決定的と言えるデータはまだありません。

以下に、細胞増殖マーカー・タンパク質を利用した、免疫組織染色による検出の特徴をまとめました。

  • 正確で信頼性が高い。
  • データが多く実績が豊富。
  • 臨床でのがんの診断や予後予測にも有用。
  • ハイスループット向きではない。
  • 結果の解釈が主観的になる可能性がある。
  • どれが最も優れたマーカーであるか、まだ結論は出ていない(特に臨床用として)。


PCNA

ゼブラフィッシュ腸の凍結切片を PCNA 抗体(ab29)で染色。

  • 存在量は、細胞周期の G1 後期から S 期で最大になり、S 期から G2 期で減少してくる。G0 期や G1 前期では少ないか、または全くない。
  • 細胞増殖マーカーとして広く用いられている9
  • 一部腫瘍で予後予測に有用。
  • 結果の解釈が主観的になる可能性がある。


Ki67

マウス脾臓のホルマリン固定パラフィン切片を Ki67 抗体 (ab15580) で染色。

  • 細胞周期の G1 期、S 期、G2 期、M 期で存在するが、G0 期には存在しない。
  • 基礎研究に加え、臨床の場においてもマーカーとして広く用いられている。
  • 多くのがんで予後予測や診断に有用9
  • 存在量と病態とがよく相関するため、がんの予後予測や治療効果の判定などに有用。
  • 結果の解釈が主観的になる可能性がある。
  • PCNA よりも特異性が高い6


MCM-2