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1. チオフラビン T(Thioflavin T; ThT)を 0.2 μm のフィルターに通した dH2O で 1 mM となるように溶解する。これを ThT ストック溶液とする。
2. ThT ストック溶液を、終濃度 25 μM になるように PBS(pH 7.4)で希釈し、マイクロプレートのウェルに添加する。
3. 凍結されている α-シヌクレイン・モノマーまたは凝集体の凍結溶液を、使用の直前に氷上で溶かす。
4. 10 nM の凝集体、もしくは 100 μM のモノマー(またはその両方)をウェルに加える。
5. プレートにシールして、37 ℃ で撹はんする(600 rpm)。
6. 蛍光マイクロプレートリーダーを用い(励起 450 nm、蛍光 485 nm)、37°C で 1 時間~72 時間までの蛍光を測定する。
10 nM の活性型 α-シヌクレイン凝集体(ab218819)と 100 μM の活性型 α-シヌクレイン・モノマー(ab218818)を組み合わせた場合(青色)、ThT蛍光曲線は増加します。この増加は α-シヌクレイン・タンパク質の凝集と相関します。一方、100 μM の活性型 α-シヌクレイン・モノマー(ab218818)と 10 nM の非活性 α-シヌクレイン凝集体コントロール(ab218817)を組み合わせた場合(紫色)、100 μM の非活性 α-シヌクレイン・モノマー・コントロール(ab218816)と 10nM の非活性 α-シヌクレイン凝集体コントロール(ab218817)を組み合わせた場合(濃青色)は、ほとんど蛍光の増加は見られません。ThT ex = 450nm、em = 485nm。
図1.ThT 蛍光曲線。α-シヌクレイン・モノマー、α-シヌクレイン・凝集体、非活性コントロールの相互作用による影響を示す。
製品
製品名 | 製品番号 |
Recombinant human alpha-synuclein protein monomer (active) | |
Recombinant human alpha-synuclein protein aggregate (active) | |
Recombinant human alpha-synuclein protein monomer (control) | |
Recombinant human alpha-synuclein protein aggregate (control) | |
Thioflavin T (ThT) |