転写因子 DNA 結合活性の研究手法

ゲルシフト・アッセイ（Gel shift assay/Electrophoretic mobility shift assay; EMSA）

比較的古くから行なわれている手法です。転写因子などの DNA 結合タンパク質を含むサンプル（精製タンパク質、核抽出物など）と、そのタンパク質の結合配列を含む DNA 断片をインキュベートし、非変性のゲルで電気泳動を行います。タンパク質－DNA 複合体はフリーの DNA よりも遅く流れるため、タンパク質が結合した DNA が存在すると、ゲル下方のフリー DNA とは別のバンドが現れます。バンドは、DNA 断片に予め標識しておいた RI やビオチンなどを利用し、オートラジオグラフィーや蛍光などで検出します。特異的な抗体を用いて結合タンパク質の種類を明確にする、スーパーシフトと呼ばれるアッセイもあります。

• 長所： 操作が比較的簡単。感度が高い。タンパク質－RNA 相互作用の研究にも適用できる。
• 短所： RI が必要（現在はビオチン－蛍光系も用いられる）。多量のサンプルを同時に処理できない。定量性がない。

​​EMSA 用の抗体一覧

クロマチン免疫沈降（Chromatin immunoprecipitation; ChIP）

生細胞をホルムアルデヒドで処理し、DNA と、DNA に結合している、あるいは近傍に存在しているタンパク質（ヒストン、転写因子など）をクロスリンク（共有結合）させてタンパク質－DNA 複合体を形成させます。DNA を抽出し、超音波または酵素でランダムに切断した後、特定のタンパク質に対する抗体を用いて免疫沈降を行なうと、フリーの DNA などは除かれ、特定のタンパク質と DNA との複合体のみが得られます。複合体中の DNA は特定のタンパク質が結合する配列を含むため、qPCR、シークエンシング、DNA チップなどの手法を用いて解析することによって、その配列の遺伝子上の部位など、さまざまな情報を得ることができます。

• 長所： 生細胞に近い状態を知ることができる。転写因子の相互作用の変化を調べることができる。複数のタンパク質との相互作用を確認することができる。
• 短所： 実験のステップが多く、多くの最適化が必要。特定のタンパク質に特異的な抗体が必要であるが、すべての 抗体が ChIP に適用できるわけではない。

​​ChIP 用抗体一覧

ELISA ベース・アッセイ

マイクロプレートを用いた ELISA 様フォーマットのアッセイ系です。特定の DNA 結合タンパク質の結合配列を含む DNA オリゴヌクレオチドを固相化したウェルに、DNA 結合タンパク質を含むサンプル（精製タンパク質、核抽出物など）を添加し、インキュベーションします。洗浄後 DNA に結合しているタンパク質を、そのタンパク質特異的な抗体で検出します。

• 長所： 操作が簡単。操作時間が短い。多量のサンプルを同時に処理できる（ハイ･スループットに適している）。結果が数字で示される（ただし半定量）。
• 短所： 研究者自身で系を構築するのは簡単ではない（通常は市販キットを用いる）。

​アブカムは NFkB、FOXO1、c-myc   などの転写因子の DNA 結合活性を、簡単かつ短時間（4 時間）の操作で測定できるキットをラインアップしています。

5 µg TPA で刺激した K-562 細胞核抽出物をサンプルとし、転写制御因子 AP1 を構成する c-Jun、c-Fos、FosB、JunB、JunD、Fra-1 それぞれの DNA 結合活性を、アブカムの測定キット ab207196 で測定した。グラフのバーはグレーがコントロール。黒は各因子の DNA 結合部位の配列を含むオリゴヌクレオチドを、白はそのミューテーション型を、それぞれ添加してインキュベーションした。黒ではウェルに固相化されたオリゴヌクレオチドと各因子との反応が、添加されたフリーのオリゴヌクレオチドによって競合阻止されたため、反応が低くなっており、このアッセイにおける反応が特異的であることを証明している。