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免疫組織染色 IHC の抗原賦活法

免疫組織染色の組織を固定する過程でマスキングされたエピトープを露出させる方法が抗原賦活化(Antigen retrieval)です。


免疫組織染色(IHC)で組織をホルマリンあるいはグルタルアルデヒドで固定する過程では、架橋反応(クロスリンク)により、ターゲット・タンパク質のエピトープがマスキングされ、抗体の抗原への結合が妨げられる場合があります。そのようなエピトープを再露出させる方法が抗原賦活化です。この抗原賦活化には大きく分けて、熱処理(Heat-Induced Epitope Retrieval HIER)と、タンパク質分解酵素処理(Proteolytic-Induced Epitope Retrieval; PIER)があります。HIER における加熱には電子レンジ、圧力鍋、蒸し器、ウォーターバス、オートクレーブなどといった機器を用いる方法があり、また過熱する際のバッファーにはさまざまな種類があります。PIER ではプロテナーゼ K、トリプシン、ペプシンなどの酵素を単独で、あるいは混合して用い、濃度、反応温度、反応時間などのさまざまな条件があります。

抗原賦活化の方法および反応条件は、用いる一次抗体のデータシートに記載されている場合にはそれに従ってください。ウサギ・モノクローナル抗体 RabMAb の場合は標準プロトコールをご参照ください。そうではない場合には、用いる一次抗体やサンプル組織の種類ごとに、最適な方法と条件の組み合わせを探す必要があります。HIER と PIER の代表的な条件を表にまとめました。条件を探す場合にはまず、2 種類の HIER(例:クエン酸バッファー(pH6.0)、Tris-EDTA バッファー(pH 9.0))と、1 ないし 2 種類の PIER(例:プロテアーゼ K、トリプシン)を試してみることをお勧めします。サイトケラチンや免疫グロブリン軽鎖など、HIER と PIER を組み合わせて初めてよい結果が得られるようなターゲットもあります。HIER の加熱法は、研究室にあって使い慣れているものを使用すればいいですが、下の表にあるように電子レンジは問題があり、避けた方が無難です。

なお凍結切片の場合のタンパク質の固定で広く用いられる酸・有機溶媒処理ではタンパク質の架橋は起こらず、抗原賦活法は必須ではありません。


HIER(熱処理)PIER(タンパク質分解酵素処理)
メリット組織に与えるダメージが少なく、また実験条件の各パラメータ調整が容易HIER による抗原賦活が難しい場合でも効果が見込める
pHクエン酸バッファー(pH 6.0)または Tris-EDTA(pH9.0)ほぼ中性のバッファー(pH 7.4)
反応温度約 95 ˚C37 ˚C
反応時間10 – 20 分程度(通常 20 分)5 – 30 分程度(通常 10 – 15 分)
バッファー組成クエン酸ナトリウム、EDTA、Tris など上記バッファーにペプシン、プロテナーゼ K、トリプシンなどを溶解
注意事項加熱に電子レンジを用いる場合、突沸による組織形態へのダメージや剥離の危険性がある。またホット・スポットやコールド・スポットの形成による不均一な抗原賦活化が起こる場合がある。酵素処理のやりすぎは組織の形態にダメージを与えるので、酵素濃度や反応時間に厳密な設定が必要である。

異なる pH の溶液を用いて HIER を行なった場合の抗原賦活化効果の違い Emoto et al., (2005) Mechanisms of Heat-induced Antigen Retrieval: Does pH or Ionic Strength of the Solution Play a Role for Refolding Antigens? J Histochem Cytochem 53 (11):1311-21. Fig. 3) より引用


抗原賦活化に便利な試薬

HIER(熱処理)用

製品名製品番号

Antigen retrieval buffer (100X Citrate Buffer pH 6.0)

抗原賦活化用バッファー 100X クエン酸(pH 6.0)

ab93678, ab94674

Antigen retrieval buffer (100X EDTA Buffer pH 8.0)

抗原賦活化用バッファー 100X EDTA(pH 8.0)

ab93680, ab94677

Antigen retrieval buffer (100X Tris-EDTA Buffer pH 9.0)

抗原賦活化用バッファー 100X Tris-EDTA(pH 9.0)

ab93684,  ab94681

Antigen retrieval buffer (100X Tris Buffer pH 10.0)

抗原賦活化用バッファー 100X Tris(pH 10.0)

ab93682, ab94680

10X Tris-HCl Buffer for HIER

抗原賦活化用バッファー 10X Tris-HCl

ab128986

10x Heat Mediated Antigen Retrieval Solution pH 6.0

抗原賦活化用バッファー 10X(pH 6.0)

ab973

Heat Mediated High pH Antigen Retrieving Solution

抗原賦活化用バッファー(高 pH)

ab972

PIER (酵素処理)用

製品名製品番号
HistoRevealab103720

Pepsin Solution ペプシン溶液

ab64201, ab128991

Proteinase K プロテアーゼ K

ab64220

Trypsin (Enzymatic Pretreatment)

抗原賦活化用トリプシン

ab128214

Trypsin Enzymatic Pretreatment Kit

抗原賦活化用トリプシン・キット

ab64205

Trypsin Enzymatic Antigen Retrieval Solution

抗原賦活化用トリプシン溶液

ab970

HistoReveal(ab103720)は PIER 用の酵素で、よく使われるトリプシンやペプシンなどに比べてサンプル組織へのダメージが少なく、一次抗体の使用量を抑えることができ、きれいな染色像が得られます。


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