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クロマチン構造、ヌクレオソーム配置、ひいては遺伝子転写のためのDNAへのアクセシビリティの大部分がヒストンタンパク質によって制御されています。各ヌクレオソームは2つの同一のサブユニットで構成されており、それぞれのサブユニットには H2A、H2B、H3、H4の4種類のヒストンが含まれています。一方、H1タンパク質はヌクレオソーム間DNAを安定化させるリンカーヒストンとして働いており、ヌクレオソーム自体の一部を形成することはありません。
図1:最も一般的なヒストン修飾 詳細については弊社のヒストン修飾に関するポスター完全版をご参照ください。
これらのヒストン修飾はまとめてヒストンコードとして知られるものを構成しており、局所ゲノム領域の転写状態を決定しています。特定領域またはゲノム全体でヒストン修飾を調べることにより、遺伝子活性化状態、プロモーター、エンハンサー、その他の遺伝子調節要素の位置を明らかにすることができます。
アセチル化
アセチル化は、転写調節に影響を及ぼすことが最初に発見された修飾の1つであることから、最も広く研究されているヒストン修飾の1つです。アセチル化により、ヌクレオソームから伸びたN末端ヒストン・テールのリジン残基に負電荷が付加されます。これらの負電荷は負に帯電したDNAと反発し、その結果としてクロマチン構造が緩みます。このオープンクロマチン構造によって転写因子の結合が可能となり、遺伝子発現が大幅に増加します (Roth et al., 2001)。
ヒストンのアセチル化は、細胞周期の調節、細胞増殖、アポトーシスに関与しており、細胞分化、DNAの複製と修復、核内輸送、神経抑制を含む他の多くの細胞プロセスの制御において重要な役割を果たしている可能性があります。ヒストンのアセチル化の平衡が崩れることと、腫瘍形成および癌の進行には関連があります。
酵素調節について
ヒストンH3とH4のリジン残基には、アセチル基がヒストン・アセチルトランスフェラーゼ(HAT)によって付加され、脱アセチル化酵素(HDAC)によって除去されます。ヒストンのアセチル化は主にプロモーター領域を標的としており、プロモーターの局所的なアセチル化として知られています。例えば、ヒストンH3上のK9およびK27のアセチル化(H3K9acとH3K27ac)は通常、活性化遺伝子のエンハンサーとプロモーターと関連があります。転写遺伝子では全体的にアセチル化レベルが低いことも知られていますが、その機能はまだ明らかになっていません。
メチル化
メチル化は、ヒストンH3およびH4のリジン残基またはアルギニン残基に付加され、転写に様々な影響を及ぼします。アルギニンのメチル化は転写活性を促進しますが(Greer et al., 2012)、リジンのメチル化はメチル化部位に応じて転写を活性化する場合と抑制的に働く場合があります。このような柔軟性は、アセチル化とは異なり、メチル化はヒストンの電荷を変化させたり、ヒストン-DNA間相互作用に直接影響を及ぼしたりしないことから説明できる可能性があります。
リジンはモノメチル化、ジメチル化、またはトリメチル化を受けることが可能であり、メチル化の各部位に応じてさらなる機能的多様性をもたらします。例えば、ヒストンH3のK4上のモノメチル化およびトリメチル化(H3K4me1とH3K4me3)はいずれも活性化マーカーですが、固有の微妙な違いがあり、H3K4me1は転写エンハンサーに認められることが多く、H3K4me3は遺伝子プロモーターに認められます。一方、K36のトリメチル化(H3K36me3)は遺伝子ボディ内の転写領域に関連する活性化マーカーです。
これとは対照的に、ヒストンH3のK9およびK27上のトリメチル化(H3K9me3とH3K27me3)は固有の機能を持つ抑制的シグナルです。H3K27me3は、Hox遺伝子やSox遺伝子を含む胚性幹細胞における発達制御を制御するプロモーター領域の一時的なシグナルです。一方でH3K9me3は、サテライト・リピート、テロメア、ペリセントロメアなどのタンデム・リピート構造を持つgene-poor染色体領域において、ヘテロクロマチンを形成するための永続的なシグナルです。また、レトロトランスポゾンおよびジンク・フィンガー遺伝子のあるファミリー(KRAB-ZFP)でも認められます。これらはいずれも不活化されたX染色体上にあり、H3K27me3は遺伝子間およびサイレンシングされたコード領域に、H3K9me3は主に活性化遺伝子のコード領域に認められます。
酵素調節について
ヒストンのメチル化は複数回の細胞分裂を経ても伝播する安定したマーカーであり、長年にわたって不可逆的であると考えられていました。しかし、最近になって、これが積極的に制御される可逆的なプロセスであることがわかりました。
メチル化:ヒストン・メチルトランスフェラーゼ(HMT)
脱メチル化:ヒストン脱メチル化酵素
リン酸化
ヒストンのリン酸化は、細胞分裂時の染色体凝縮、転写調節、DNA損傷の修復における重要な中間ステップです(Rossetto et al., 2012, Kschonsak et al., 2015)。アセチル化やメチル化とは異なり、ヒストンのリン酸化は他のヒストン修飾間の相互作用を確立し、エフェクター・タンパク質のプラットフォームとして働くことでイベントの下流カスケードを開始する引き金となります。
リン酸化はすべてのコア・ヒストンで発生し、それぞれに異なる作用があります。ヒストンH3のS10とS28におけるリン酸化およびヒストンH2AのT120におけるリン酸化は、クロマチン凝集や、有糸分裂中のクロマチンの構造と機能の調節に関わっています。これらは細胞周期および細胞増殖の重要なマーカーであり、真核生物全体にわたって保存されています。H2AXのS139におけるリン酸化(γH2AXとなる)はDNA損傷修復タンパク質のリクルートポイントとして働き(Lowndes et al., 2005, Pinto et al., 2010)、DNA二本鎖の切断後に最も早く起こるイベントの1つです。H2Bのリン酸化はあまり研究されていませんが、アポトーシスに関連するクロマチン凝縮、DNA断片化、細胞死を促進することが明らかになっています(Füllgrabe et al., 2010)。
ユビキチン化
すべてのヒストン・コアタンパク質にはユビキチン化される可能性がありますが、H2AとH2Bはもっともよくユビキチン化されており、核内で最もユビキチン化される頻度が高いタンパク質のうちの2つとなっています(Cao et al., 2012)。ヒストンのユビキチン化はDNA損傷に対する応答で中心的役割を担っています。
ヒストンH2A、H2B、H2AXのモノユビキチン化はDNA二本鎖切断部位に認められます。最もよく見られるのは、H2AのK119およびH2BのK123(酵母)/K120(脊椎動物)におけるモノユビキチン化です。モノユビキチン化されたH2Aは遺伝子サイレンシングにも関連がありますが、H2Bでは転写活性化にも関連があります。
ポリユビキチン化は、頻度は低いですが、DNA修復においても重要です。H2AおよびH2AXのK63におけるポリユビキチン化は、RAP80のようなDNA修復タンパク質の認識部位となります。
酵素調節について
他のヒストン修飾と同様に、H2AおよびH2Bのモノユビキチン化は可逆的であり、ヒストン・ユビキチン・リガーゼおよび脱ユビキチン化酵素によって厳密に制御されています。
モノユビキチン化
ポリユビキチン化
ヒストン修飾に関するクイックリファレンスガイド
最もよく見られるヒストン修飾とその位置:
ヒストン修飾 機能 部位
H3K4me1 活性化 エンハンサー
H3K4me3 活性化 プロモーター
H3K36me3 活性化 遺伝子ボディ
H3K79me2 活性化 遺伝子ボディ
H3K9Ac 活性化 エンハンサー, プロモーター
H3K27Ac 活性化 エンハンサー, プロモーター
H4K16Ac 活性化 反復配列
H3K27me3 抑制 プロモーター、gene-rich領域
H3K9me3 抑制 サテライト・リピート、テロメア、ペリセントロメア
γH2A.X DNA損傷 DNA二本鎖切断
H3S10P DNA複製 有糸分裂染色体
ChIPでは抗体を用いて、タンパク質または目的とする修飾をそれが結合するDNAと共に分離します(図5)。次にDNAの塩基配列決定を行い、ゲノムにマッピングしてタンパク質または修飾の部位と量を特定します。
図2:ヒストン修飾のChIP 抗体は修飾されたヒストン・テールに直接結合します。免疫沈降とDNAの精製により、修飾が占めるゲノム領域の分離・同定が可能となります。
ChIP実験において特定のヒストンおよびヒストン修飾に対する抗体を利用することにより、以下の特定の部位を明らかにすることができます。
ヒストン修飾の機能が分かっている場合、ChIPを使用すればゲノム全体のこのヒストン修飾シグネチャーおよび対応する機能のある、特定の遺伝子や領域を特定することができます。次に、これらの遺伝子および領域について、目的とする生物学的プロセスにおけるその役割についてさらに検証することができます。例えば、H3K4me1に対してChIPを使用することによってゲノム全体にわたってアクティブなエンハンサーの位置および配列を明らかにし、目的とする遺伝子および遺伝子プログラムの位置を特定することができます。
あるいは、ヒストン修飾の機能が不明な場合には、ChIPではこのシグネチャーがある塩基配列、遺伝子、位置を特定することが可能であり、それによって修飾の機能を推測することができます。この技術はヒストンコードの大部分を解読する上で中心的な存在であり、ユビキチン化や他の新規マーキングのような新たに発見された修飾の機能を確認する上でも依然として有用です。
ヒストン修飾は、特定の酵素によってヒストンタンパク質に動的に付加されたり、除去されたりします(表1)。これらのライターとイレイサーのバランスにより、ヒストン上にどの程度のレベルでどのマークが存在するかが決まり、最終的に特定の遺伝子プログラムとそれが調整する細胞プロセスをオンまたはオフにするかを制御しています。
表1:ヒストンのライターおよびイレイサーの主なカテゴリー
修飾 | ライター(writer) | イレイサー(eraser) |
アセチル化 | ヒストン・アセチルトランスフェラーゼ(HAT) | ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC) |
メチル化 | ヒストン・メチルトランスフェラーゼ(HMT/KMT)およびタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ(PRMT) | リジン脱メチル化酵素(KDM) |
リン酸化 | キナーゼ | ホスファターゼ |
ヒストン修飾のリーダー、ライター、イレイサーの詳細については、当社のエピジェネティック修飾に関するポスターをご覧ください。
修飾経路や働いている特定のライター、イレイサーを同定することにより、以下のようなことを明らかにすることができます。:
医薬品開発の取り組みに対しては、ライターやイレイサーの活性に与える影響について容易に化合物のスクリーニングを行うことができます。
ヒストンメチル化経路の解析
一般に、ヒストン・メチルトランスフェラーゼ(HMT)のアッセイは開発が難しく、ほとんどはアッセイデザインが原因のいくつかの欠点があります。典型的なHMTアッセイではメチル供与体として3H-SAMを利用し、メチル化反応の一般的な副生成物としてS-アデノシルホモシステイン(SAH)を測定します。ただし、これには次のことが必要となります。
アブカムのHMT活性アッセイは、特定のメチル化産物を検出する抗体を用いて特定のHMTの活性を評価することによってこれらの問題を克服し、次のような特徴があります。
当社のヒストンのメチル化アッセイの詳細については、ここをクリックしてください。
脱メチル化酵素活性の解析
ヒストン脱メチル化酵素活性アッセイでは通常、脱メチル化の副生成物であるホルムアルデヒドの生成を測定します。したがって、これらのアッセイは界面活性剤、チオール基および各種イオンによる影響を受けやすいという性質があります。メチル化アッセイと同様に、これらのアッセイは脱メチル化酵素に特異的ではなく、精製されたタンパク質しか使用できません。
アブカムのヒストン脱メチル化酵素アッセイは、脱メチル化産物の生成を直接測定することによってこれらの問題を回避しており、次のような特徴があります:
当社のヒストンの脱メチル化酵素アッセイの詳細については、ここをクリックしてください。
ヒストンアセチル化経路の解析
アブカムでは、H4に特異的なHAT活性だけでなく、全体を分析するキットを提供しています。これらのアッセイでは、HATを触媒としたアセチルCoA供与体からヒストンペプチドへのアセチル基の移行(アセチル化ペプチドおよびCoA-SHを産生)を測定します。次に、CoA-SH副生成物を比色法または蛍光法により測定します:
ヒストン脱アセチル化酵素活性の解析
HDACタンパク質は、機能およびDNA配列の類似性に基づいて、4つの主要グループ(クラスI、クラスIIA、クラスIIB、クラスIII、クラスIV)に分類されます。クラスI、IIAおよびIIBはトリコスタチンA(TSA)によって活性が阻害される「古典的」HDACと考えられている一方で、クラスIIIはTSAの影響を受けないNAD+-依存性タンパク質[サーチュイン(SIRT)]のファミリーに属しています。クラスIVは、他とのDNA配列の類似性のみに基づいて単独の非定型クラスと考えられています。
これらのクラスはそれぞれ異なる細胞プログラムと関連しており、様々な蛍光アッセイを用いて個別に測定が可能です。例えば、SIRTは一般にがんや神経疾患と関連しています。SIRT活性の検出、またはSIRT活性に影響を及ぼす薬剤の特定は、これらの疾患に対する新たな診断戦略または治療戦略を示す可能性があります。
蛍光アッセイでは、アミノ末端およびカルボキシル末端に蛍光色素分子およびクエンチャーを持つアセチル化ペプチド基質を用います。一旦基質が脱アセチル化されると、ペプチダーゼによる切断が可能となり、クエンチャーから蛍光色素分子が解放されます。それに続く蛍光色素分子に生じる蛍光色素濃度の上昇は脱アセチル化酵素の活性に正比例します。
ライターおよびイレイサーの阻害
これらの修飾酵素を低分子化合物により阻害し、その後の下流の結果を評価してヒストン修飾の関与や生物学的機能を調べる方法が有用です。したがって、ライターおよびイレイサーの阻害剤は、エピジェネティックな修飾経路の役割を理解する上で非常に重要なツールとなっています。また、学術的・産業的観点から、前臨床試験において「新薬の開発につながるような」標的を検証する際にも不可欠となっています。
当社のヒストン・メチルトランスフェラーゼおよび脱メチル化酵素の阻害剤についてはこちら
ヒストン修飾は、クロマチンの物理的性質、およびそれに対応する転写状態を直接的に(例:負に帯電したDNAと反発するアセチル基によりオープンクロマチン構造を形成する)、またはエフェクターと呼ばれるタンパク質アダプターを介して調節します。エフェクター・タンパク質は、特定のエピジェネティックマークを認識して結合し、その後、分子機構によってクロマチン構造を変化させます。これらのエピジェネティックなリーダーは、ヒストンコードを動作に変換することによって、ヒストン修飾の機能的帰結を決定します。
特定のヒストン修飾を認識するエフェクタードメイン
エフェクター・タンパク質は、モジュールとして知られるエフェクタードメインを介してヒストン修飾マークを認識し、結合します(表2)。
表2. モジュールまたはヒストン結合タンパク質によるヒストンマークの認識
ヒストン結合またはエフェクターモジュール | 既知のヒストンマーク |
クロモドメイン | H3K4me2/3, H3K9me2/3, H3K27me2/3 |
Tudor | H3K4me3, H4K20me2 |
MBT | H3K4me1, H4K20me1/2, H1K26me1 |
WD40リピート | R2/H3K4me2 |
ブロモドメイン | Kac |
PHD | H3K4, H3K4me3, H3K9me3, K36me3 |
14-3-3 | H3S10ph |
BRCT | H2A.XS139 |
これらのモジュールは、モジュールの結合ポケットに並んだアミノ酸によって特定のヒストン修飾を認識します。一方で、この結合ポケット外の残基(特にN+2位およびN-2位)は、修飾されるヒストンおよびアミノ酸残基(例:H3K4 vs H4K20)に対する特異性を規定しています。
結合ポケットの内外の残基にはわずかなばらつきがあるため、類似したエピジェネティックマークも認識することができます。例えば、エフェクター・タンパク質は、メチル結合モジュールの構造のわずかなばらつきによって、モノメチル化、ジメチル化、またはトリメチル化の各状態を識別することができます。例えば、Tudorドメインはジメチル化またはトリメチル化リジンにのみ選択的に結合する一方で、PHDフィンガーモジュールは両方に結合するか、または未修飾のリジンにのみ結合する可能性があります(Ruthenburg et al., 2007)。
多価性により実現されるヒストンコードの複雑性
同じタンパク質やタンパク質複合体上に複数のヒストン結合モジュールが見られることは多く、これによってヒストン修飾の特定の組合せを認識することが可能になります。これによって、ヒストン修飾が単独で解釈されるのではなく互いに相互作用する、より複雑なヒストンコードが可能となります。
ヒストン修飾の多価的な関与は、複合的な特異性を持ち、親和性が増強された個別のマーキングパターン認識に重要であり、同時に多様かつ正確な下流の作用を可能にします。例えば、1つのエピジェネティックマーク(H3K4me3など)がある状況下で遺伝子転写を活性化し、周囲のマークに応じて別の状況下ではそれを抑制することもあります。表3に、異なるヒストン修飾の組み合わせの機能的関連性の例を示します(Ruthenburg et al., 2007)。
表3:併存するヒストンとDNA修飾の機能的関連性
ヒストンマーク | クロマチンの状態 |
H3K4me2/3 + H4K16ac | 転写活性をもつホメオティック遺伝子 |
H3K4me2/3 + H3K9/14/18/23ac | 転写活性クロマチン |
H3S10ph + H3K14ac | マイトジェン刺激性転写 |
H3K4me3 + H3K27me3 | 二価ドメイン |
H3K9me3 + H3K27me3 + 5mC | サイレント遺伝子座 |
H3K27me3 + H2AK119ub1 | サイレントホメオティック遺伝子 |
H3K9me3 + H4K20me3 + 5mC | ヘテロクロマチン |
H3K9me2/3 + H4K20me1+ H4K27me3 + 5mC | 不活性X染色体 |
1つのタンパク質またはタンパク質複合体内の複数のエフェクターモジュールが、同じヒストンおよび/またはヌクレオソーム上のヒストン修飾と、あるいはそれらをまたいで相互作用することがあります。これらの相互作用は以下のように分類されます。
ヌクレオソーム内:同じヌクレオソームに結合
ヌクレオソーム間:異なるヌクレオソームに結合
癌におけるヒストン変異に関心をお持ちの場合は、当社のヒストンH3変異(英語)に関する論文をご覧ください。
参考文献:
Cao, J. & Yan, Q. Histone ubiquitination and deubiquitination in transcription, DNA damage response, and cancer. Front. Oncol. 2, 26 (2012).
Füllgrabe, J., Hajji, N. & Joseph, B. Cracking the death code: apoptosis-related histone modifications. Cell Death Differ. 17, 1238–1243 (2010).
Greer, E. L. & Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343–57 (2012).
Kschonsak, M. & Haering, C. H. Shaping mitotic chromosomes: From classical concepts to molecular mechanisms. BioEssays 755–766 (2015)
Lowndes, N. F. & Toh, G. W.-L. DNA repair: the importance of phosphorylating histone H2AX. Curr. Biol. 15, R99–R102 (2005).
Pinto, D. M. S. & Flaus, A. Structure and function of histone H2AX. Subcell. Biochem. 50, 55–78 (2010).
Rossetto, D., Avvakumov, N. & Côté, J. Histone phosphorylation: A chromatin modification involved in diverse nuclear events. Epigenetics 7, 1098–1108 (2012)
Roth, S. Y., Denu, J. M. & Allis, C. D. Histone acetyltransferases. Annu. Rev. Biochem. 70, 81–120 (2001)
Ruthenburg, A.J., Li, H., Taverna, S.D., Patel, D.J. & Allis, C.D. Multivalent engagement of chromatin modifications by linked binding modules. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8, (2007)