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ウサギ・モノクローナル抗体開発者インタビュー

ほんの数年前までは研究者の皆さんから「初めて聞きました」と言われることの多かったウサギ・モノクローナル抗体ですが、最近ではすっかりおなじみとなり、研究には欠かせないツールとなっています。そのウサギ・モノクローナル抗体がアブカムに本格的にラインアップされるようになったのは、代表的なメーカーである Epitomics 社が 2012 年、アブカム・グループの一員になったところから始まります。

当時アブカムの日本オフィスは、ウサギ・モノクローナル抗体がどのようなものであるのかをよく理解しておらず、今後この製品をどのように日本に紹介していくべきなのか分かっていませんでした。そこでこの抗体とはどのようなものなのか、またどのようなメリットがあるのか、これらを詳しく知りたいと思い 2013 年、サンフランシスコ近郊の町バーリンゲームにある Epitomics 社の本社(現 Abcam バーリンゲーム・オフィス)を訪問し、Epitomics 社の上級副社長であり設立者の一人でもある Weimin Zhu 氏(肩書は当時:現 Abcam)にお話を伺いました。


    Weimin Zhu 氏

ウサギ・モノクローナル抗体は優れた研究用ツール

-まずはウサギ・モノクローナル抗体について簡単に教えてください。

研究用抗体として最も広く用いられているのはウサギ・ポリクローナル抗体です。ウサギ由来抗体は、同じく抗体産生動物として用いられているマウス由来抗体よりも抗原認識能が多彩でかつ厳密であり、また高い親和性を有するというメリットがあります*1。しかしながらポリクローナルであるゆえ、ロット間での性能差があるなど品質上のデメリットもあります。ウサギ・モノクローナル抗体は、ウサギ由来であることからの抗体としての高い性能と、モノクローナルであることからの安定した品質の、いいとこ取りをした抗体です*2。実験動物として最も広く用いられているマウスのサンプルに使いやすいという点も見逃せないポイントです*3

*1 ウサギ免疫システム
*2 選ばれる 8 つの理由
*3 マウス・サンプルにはウサギ・モノクローナル抗体を

-そのような優れた抗体がこれまで研究用抗体としてあまり市販されていなかったのはなぜですか?

ご存知の通り、モノクローナル抗体として最も広く用いられているのはマウス由来のもので、通常、免疫したマウスの抗体産生細胞とマウス由来ミエローマから、細胞融合法により作製したハイブリドーマに産生させます。一方ウサギについては長らく実用に堪え得るミエローマ株が存在せず、それゆえウサギ・モノクローナル抗体というのは一般的ではありませんでした。しかしシカゴの Loyola 大学で樹立されたミエローマ株 240E は、細胞融合のパートナー細胞として優れたものでした。私たちはその細胞株と技術をベースとして 2001 年、Epitomics 社を設立しました。世界的にウサギ・モノクローナル抗体が市販され始めたのはそれからになります。


RabMAb® と Abcam のこれから

-Epitomics 社のこれまでの歩みをお話しいただけますか?

私たちは細胞融合法によるウサギ・モノクローナル抗体作製の国際的な特許を有しており、この技術とそれによって作製された抗体を RabMAb® と称しています。これまで多くの RabMAb® を研究用抗体として製品化してきましたが、これらはさまざまな実験において優れた抗体であることが証明され、RabMAb® は広く知られるようになってきました。現在では中国の Hangzou(杭州)にも拠点を有し、製造はそこで行っています。2012 年に Abcam グループの一員となりましたが、これは Abcam を通して世界中の研究者の皆さんに、もっとRabMAb® の素晴らしさを知っていただくことが最大の目的です。

-RabMAb® は診断薬や抗体医薬の分野にも応用されているとお聞きしましたが?

私たちはこれまで、世界中の大学、研究所、製薬企業などから受託作製の依頼を受け、数多くの RabMAb® を作製してきました*4。作製された RabMAb® のいくつかは臨床診断用キットに組み込まれています。また免疫組織染色の診断用抗体としてアメリカやヨーロッパで認可されている RabMAb® も数多くあります。ヒト化された後、製薬企業の手によって抗体医薬として臨床試験にまで進んでいる抗体もあり、これには私たち Epitomics 社も大きな期待を寄せています。

*4 受託作製サービス

-RabMAb® と Abcam のこれからの展開をお教えください。

研究用抗体としては、ライフサイエンス研究のターゲットとなるタンパク質を網羅する包括的なラインアップを目標として、これまで 4,500 種類以上の RabMAb® を製品化して来ました。しかしまだその目標には達していないと認識しており、今後 1 年間で 1,000 種類以上の製品をリリースする予定です*5。前にも述べましたが、それと同時に、まだ RabMAb® を試したことのない研究者の皆さんに、その素晴らしさを知っていただくことも重要であると考えており、宣伝・広報活動に一層力を入れたいと思っています。

*5 2016 年 10 月現在 Abcam から販売されている RabMAb® 製品の数は約 10,000

関連リンク


RabMAb
ポータル

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受託作製サービス

RabMAb
カタログ

細胞増殖研究ガイド – 増殖細胞識別ツール

培養細胞や組織における増殖細胞の検出は、化合物の毒性や腫瘍の予後を判別・予測する際などで、広く行なわれます。その増殖細胞の検出に用いられる方法としては、増殖細胞マーカータンパク質の検出、細胞代謝能の測定、DNA 合成(DNA に取り込まれたプローブ)の検出などがあります。

増殖細胞マーカータンパク質

代表なタンパク質である Ki67 を抗体で検出する方法は、基礎研究と臨床研究、どちらのにおいても豊富な実績があり、確立されていますが、実験の目的によっては PCNA や MCM-2 に対する抗体も使用されます。

マーカー特性とメリットデメリットおすすめ製品
PCNA
  • G1 後期および S 期にいる細胞の検出に有用
  • 一部腫瘍においては予後予測に有用
  • 結果の解釈が主観的になる可能性がある
  • Ki67 に感度や特異性で劣る
  • Anti-PCNA Mouse-Mono(ab29
  • Anti-PCNA antibody Rabbit-Mono(ab92552
  • Human PCNA ELISA Kit(ab196270
Ki67
  • G1 期、S 期、G2 期、M 期の細胞の検出に有用
  • 一部腫瘍においては予後予測に有用
  • 実績やデータが豊富
  • 結果の解釈が主観的になる可能性がある
  • 一部の腫瘍においては MCM-2 に感度や特異性で劣る
MCM-2
  • G1 期、S 期、G2 期、M 期の細胞の検出に有用
  • 一部腫瘍においては予後予測に有用
  • 結果の解釈が主観的になる可能性がある

細胞代謝能の測定

最も一般的な手法は MTT(Thiazolyl blue tetrazolium bromide)ですが、この他に XTT、WST-1 などがあり、感度などの特性が異なります。

マーカー特性とメリットデメリットおすすめ製品
MTT
  • 細胞呼吸を定量測定し、間接的に増殖細胞を検出
  • シンプルなプロトコール
  • 細胞増殖を直接測定しているわけはない
  • 細胞傷害性がある
  • 生成されるホルマザン色素が培地に不溶なので、測定前に溶媒で溶解する必要がある
  • エンドポイントでの測定のみ可能(経時変化を追うことはできない)
  • Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) (ab146345
XTT
  • 細胞呼吸を定量測定し、間接的に増殖細胞を検出
  • シンプルなプロトコール
  • MTT より高感度
  • 細胞増殖を直接測定しているわけはない
  • 実験条件により感度が変わる
WST-1
  • 細胞呼吸を定量測定し、間接的に増殖細胞を検出
  • シンプルなプロトコール
  • XTT よりさらに高感度
  • 細胞増殖を直接測定しているわけはない
  • WST-1 Cell Proliferation Reagent - ready to use (ab155902

チミジン・アナログを用いた DNA 合成の検出

DNA 合成の検出における代表的なプローブは 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(5-bromo-2'-deoxyuridine; BrdU)ですが、経時変化を観察する場合には 5-ヨード-2'-デオキシウリジン((+)-5-Iodo-2'-deoxyuridine; IdU)または 5-クロロ-2'-デオキシウリジン(5-Chloro-2'-deoxyuridine; CldU)が、生細胞を用いる場合には 5-エチニル-2'-デオキシウリジン(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine; EdU)が、それぞれ適しています。

マーカー特性とメリットデメリットおすすめ製品
BrdU
  • G1 期、S 期、G2/M 期それぞれにいる細胞の割合や、細胞周期の動態を検出するのに有用
  • 抗体での検出には DNase、熱、酸などによる DNA 変性処理が必要
  • DNA 変性処理により DNA や他の抗原の構造を壊す場合があり、他のターゲットとの多重染色には適さない
  • Anti-BrdU Rat-Mono(ab6326
  • Anti-BrdU Sheep-Poly(ab1893
  • BrdU(ab142567
  • BrdU Cell Proliferation ELISA Kit - Colorimetric(ab126556
  • BrdU Cell Proliferation ELISA Kit - Chemiluminescent(ab126572
  • In situ BrdU-Red DNA Fragmentation(TUNEL)Assay Kit(ab66110
IdU

CldU

  • DNA 複製フォークの進行速度、安定性、複製起点の点火の研究に有用
  • 二種類のプローブを同時に用いることで、経時変化の観察など複雑な研究が可能
  • 抗体での検出には DNase、熱、酸などによる DNA 変性処理が必要
  • DNA 変性処理により DNA や他の抗原の構造を壊す場合があり、他のターゲットとの多重染色には適さない
EdU
  • G1 期、S 期、G2/M 期それぞれにいる細胞の割合や、細胞周期の動態を検出するのに有用
  • 抗体による検出とそれに伴う変性処理が必要なく、よりシンプルなプロトコール
  • 値段が高い

関連リンク


増殖細胞研究ガイド
- DNA 合成

注目ターゲット
Ki67

細胞増殖研究ガイド-DNA 合成

チミジン・アナログを用いた DNA 合成の検出

増殖細胞を検出するために最も確実な方法は、細胞の DNA 合成を検出することです。それには、DNA 合成が行なわれる際に DNA に取り込まれる(細胞・DNA をラベルする)、チミジン・アナログ(チミジン類似物質)などのプローブを細胞と共に培養し、取り込まれたプローブを検出する方法があります。

プローブとして最も広く用いられているチミジン・アナログは、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(5-bromo-2'-deoxyuridine; BrdU)です。また、5-ヨード-2'-デオキシウリジン((+)-5-Iodo-2'-deoxyuridine; IdU)、5-クロロ-2'-デオキシウリジン(5-Chloro-2'-deoxyuridine; CldU)、5-エチニル-2'-デオキシウリジン(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine; EdU)といった化合物も使用されます。このようなチミジン・アナログは DNA 合成を行なう細胞に効率よく取り込まれますが、DNA へのダメージ、細胞の変異、細胞周期への影響などが起こることがありますので注意が必要です1,2

チミジン・アナログの検出は、抗体を用いた方法の他、プローブに標識された蛍光色素や RI などを直接検出する方法もあり、免疫組織染色(IHC)、免疫細胞染色(ICC)、ELISA、フローサイトメトリーなど、さまざまなアプリケーションで行なわれます。また、マルチプレックスに対応しているキットを用いれば、ハイスループットな検出も可能です。検出の特徴には、次の通りです。

  • 得られる結果が正確である。
  • ハイスループット、ロースループットのどちらの方法にも適応が可能である。
  • 比較的時間がかかる。
  • EdU を除き検出には DNA 変性処理が必要なため、他のターゲットとの多重染色には適さない。

  BrdU


  IdU


  CldU


  EdU

BrdU


BrdU を取り込ませた Ramos 細胞株移植組織 FFPE 切片を、BrdU 抗体(ab1893)を用いて免疫組織染色で検出

  • DNA 合成時に取り込まれるチミジン・アナログ
  • 増殖細胞および娘細胞をラベルする
  • BrdU 抗体で検出する
  • G1 期、S 期、G2/M 期それぞれにいる細胞の割合や、細胞周期の動態を検出するのに有用
  • 抗体での検出には DNase、熱、酸などによる DNA 変性処理が必要
  • DNA 変性処理により DNA や他の抗原の構造を壊す場合があり、他のターゲットとの多重染色には適さない

IdU および CldU


IdU を取り込ませたマウス大腸組織の FFPE 切片を、IdU 抗体(ab187742)を用いて免疫組織染色で検出

  • DNA 合成時に取り込まれるチミジン・アナログ
  • 増殖細胞および娘細胞をラベルする
  • 二種類のプローブを同時に用いることで、経時変化の観察が可能
  • DNA 複製フォークの進行速度、安定性、複製起点の点火の研究に有用
  • BrdU 抗体および IdU 抗体で検出する
  • BrdU 抗体の、CldU への交差反応性と IdU に対する交差反応性は抗体の種類によって異なるため、BrdU と多重染色を行なう場合には注意が必要
  • 抗体での検出には DNase、熱、酸などによる DNA 変性処理が必要
  • DNA 変性処理により DNA や他の抗原の構造を壊す場合があり、他のターゲットとの多重染色には適さない

EdU


DNA に取り込まれた BrdU を抗体で検出するには DNA 変性処理が必要だが(左)、DNA に取り込まれた EdU には蛍光色素を直接結合させることが可能(右; クリック・ケミストリー)

  • DNA 合成時に取り込まれるチミジン・アナログ
  • 増殖細胞および娘細胞をラベルする
  • G1 期、S 期、G2/M 期それぞれにいる細胞の割合を検出するのに有用
  • Click chemistry による検出が可能
  • エチニル基に Alexa Fluor® などの蛍光色素を直接標識することができ、膜透過性が高い
  • 変性処理が不要であり、多重染色が可能
  • 抗体による検出とそれに伴う変性処理が必要なく、よりシンプルなプロトコール

おすすめ製品

アナログ抗体キット
  • BrdU Cell Proliferation ELISA Kit - Colorimetric(ab126556
  • BrdU Cell Proliferation ELISA Kit - Chemiluminescent(ab126572
  • In situ BrdU-Red DNA Fragmentation(TUNEL)Assay Kit(ab66110

参考文献

1. Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D. & Rakic, P. Everything that Glitters Isn't Gold: A Critical Review of Postnatal Neural Precursor Analyses. Cell Stem Cell 1, 612–627 (2007). PMID: 18371403

2. Anda, S., Boye, E. & Grallert, B. Cell-cycle analyses using thymidine analogues in fission yeast. PLoS One 9, 1–9 (2014). PMID: 24551125

関連リンク


増殖細胞研究ガイド
- 増殖細胞識別ツール

BrdU 免疫組織染色
プロトコール

T 細胞サブタイプとサイトカイン

免疫の促進や抑制の中心となる細胞である T 細胞(T cell)には、ヘルパー T 細胞(Th)、濾胞性ヘルパー T 細胞(Tfc)、制御性 T 細胞(Treg)などさまざまな種類があり、さらに Th1、Th2 といったサブタイプに分類されます。これら細胞はそれぞれ各種分化誘導因子やサイトカインなどの分子の影響を受け、また影響を与えています。これら分子を細胞のタイプごとにまとめました。

因子名をクリックすると、関連製品のリストが開きます。

細胞のタイプ分化誘導因子エフェクター・サイトカイン制御性転写因子
Th1IL-2IL-2T-bet / Tbx21
IL-12IL-10STAT4
IL-18IFN-γSTAT1
IL-27TNF-α
IFN-γLT-α(TNF-β)
Th2IL-2IL-2GATA3
IL-4IL-4STAT6
IL-6IL-5c-MAF
IL-17EIL-6
IL-31IL-10
IL-33IL-13
TNF-α
Th9IL-4IL-9PU.1
TGF-βIL-10IRF-4(MUM1)
IL-21
Th17IL-1βIL-17aRORγ t
IL-6IL-17fSTAT3
IL-21RORα
IL-23IL-22
TGF-βIL-26
TNF-α
CCL20(MIP3α)
GM-CSF
Th22IL-6IL-22AHR
TNF-αTNF-αBNC2
CCL15(MIP5)FOXO4
CCL17(TARC)
TfcIL-6IL-4BCL-6
IL-21IL-10STAT3
CXCL13(BCA1)IL-12
IL-21
TregIL-2IL-10FOXP3
TGF-βIL-35(IL-12α+IL-27β)STAT5
TGF-βFOXO1
FOXO3

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Immunology
ポータル

T 細胞活性化
インタラクティブ・パスウェイ

IL-6 受容体
インタラクティブ・パスウェイ

ニューロサイエンス実験プロトコール集

アブカムはニューロサイエンス分野における抗体を幅広くカバーしています。そしてこれら豊富な抗体を使用して行う各種実験のプロトコールを公開しています。ぜひご参照ください。

 

すべて英文です。

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Neuroscience
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アプリケーション別
技術情報

フローサトメトリー RabMAb 標準プロトコール

ウサギ・モノクローナル抗体 RabMAb® のフローサイトメトリー(Flowcytometry; FCM, FlowCyt)の性能確認はアブカムのラボにおいて、下記のプロトコールに従って行われています。試薬、機器、手技などは適宜ご自身のラボの方法に準じて使用し、操作を行ってください。

1. 準備する試薬

  1. PBS:ダルベッコ PBS
  2. ブロッキング溶液:0.5 % BSA / PBS
  3. 2 % パラホルムアルデヒド:パラホルムアルデヒドを 70 ℃ に加熱したダルベッコ PBS に溶解させる(実験ごとに用時調製)
  4. 細胞透過溶液:BD Biosciences社 FACS permeabilizing solution カタログ番号 340973
  5. 蛍光標識二次抗体:一次抗体の動物種および必要とする波長に適した蛍光標識二次抗体を選択すること

2. 操作手順

  1. 1 サンプルあたり 1 x 106 個の細胞を準備する。
  2. 細胞をブロッキング溶液で 1 回洗浄する。
  3. 2 % パラホルムアルデヒドを加え、室温で 10 分間インキュベーションして細胞を固定する。
  4. 細胞をブロッキング溶液で 1 回洗浄する。
  5. 0.5 ml の細胞透過溶液を加え、室温で 10 分間作用させる。
  6. 細胞をブロッキング溶液で 1 回洗浄する。
  7. 細胞にブロッキング溶液を新たに加え、室温で 30 分間ブロッキングする。
  8. 希釈した一次抗体を細胞に加え、室温で 30 分間反応させる。希釈濃度はデータシートなどを参照すること。
  9. 細胞をブロッキング溶液で 2 回洗浄する。
  10. 蛍光二次抗体を加え、室温で 30 分間反応させる。希釈濃度はデータシートなどを参照すること。
  11. 細胞をブロッキング溶液で 2 回洗浄する。
  12. 細胞を PBS で再懸濁し、フローサイトメーターに供する。

※ 細胞懸濁液中に細胞魂があるままフローサイトメーターに供すると、ラインに細胞が詰まる場合がある。細胞魂がある場合には、細胞懸濁液をセルストレーナーまたはメッシュに通してから使用すること。
※サンプルは 1 % パラホルムアルデヒド溶液に浸し、4 ℃ で一晩保存が可能。

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RabMAb
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ウエスタン・
ブロッティング
RabMAb 標準
プロトコール

免疫組織染色
RabMAb 標準
プロトコール

免疫細胞染色
RabMAb 標準
プロトコール

免疫細胞染色 RabMAb 標準プロトコール

ウサギ・モノクローナル抗体 RabMAb® の免疫細胞染色 (Immunocytochemistry; ICC) の性能確認はアブカムのラボにおいて、下記のプロトコールに従って行われています。試薬、機器、手技などは適宜ご自身のラボの方法に準じて使用し、操作を行ってください。

1. 準備する試薬

  1. PBST 洗浄バッファー (0.1 % Tween-20 / ダルベッコ PBS)
  2. 2 % パラホルムアルデヒド *1
  3. 0.1 % Triton X-100
  4. ブロッキング溶液 *2
  5. ブロッキング溶液 : 10 % 血清 / PBS (血清は使用する 蛍光標識二次抗体の免疫動物血清とする)
  6. 一次抗体希釈液 : 5 % 血清 / PBS (血清は使用する 蛍光標識二次抗体の免疫動物血清とする)
  7. 封入剤 (蛍光染色用)
  8. アセトン

2. 操作手順

2.1 細胞の準備

  1. 細胞培養は、カバースリップ付のチャンバー・スライド、あるいは 6 ウェルプレートで行う。細胞数はコンフルエントの 80 % を超えないこと。

2.2 細胞の固定

  1. 容器から培地を取り除き、細胞を PBST 洗浄バッファーで 1 回洗浄する。
  2. 2 % パラホルムアルデヒドで 20 分間固定する。細胞によっては (HeLa など)、アセトンを -20 ℃ 5 分間反応させ、固定と透過処理を同時に行う。この場合、次のステップとして 2.2-5 に進む。
  3. 細胞を PBST 洗浄バッファーで 2 回洗浄する。
  4. 0.1 % Triton X-100 で 5 分間透過処理する。
  5. 細胞を PBST 洗浄バッファーで 2 回洗浄する。

2.3 ブロッキング

  1. ブロッキング溶液を加え、室温 1 時間、あるいは 4 ℃ 一晩反応させ、ブロッキングする。

2.4 染色

  1. 一次抗体をブロッキング溶液で希釈する。希釈濃度に関しては一次抗体のデータシートを参照のこと。
  2. 希釈した一次抗体を細胞に加えて 4 ℃で一晩インキュベートする。
  3. 細胞を PBST 洗浄バッファーで 2 回洗浄する。
  4. PBS で希釈した二次抗体を細胞に加え、暗所で室温 45 分間インキュベートする。希釈濃度に関しては二次抗体のデータシートを参照のこと。
  5. 細胞を PBST 洗浄バッファーで 2 回洗浄する。
  6. 300 nM DAPI を暗所で室温 5 分間インキュベートし、核を対比染色する。
  7. 細胞を PBST 洗浄バッファーで 3 回洗浄する。
  8. 封入剤で封入する。反応後のスライドはなるべく暗所で扱う。また、スライドの保管も暗所で行う。

*1 パラホルムアルデヒドを 70 ℃ に加熱したダルベッコ PBS に溶解させる (実験ごとに用時調製)。
*2 ダルベッコ PBS に二次抗体のホスト動物に由来する血清を 10 % 加えて調製する。

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RabMAb
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ウエスタン・
ブロッティング
RabMAb 標準
プロトコール

免疫組織染色
RabMAb 標準
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フローサイトメトリー
RabMAb 標準
プロトコール

ウエスタン・ブロッティング RabMAb 標準プロトコール

ウサギ・モノクローナル抗体 RabMAb® のウエスタン・ブロッティング (Western blotting; WB) における性能確認はアブカムのラボにおいて、下記のプロトコールに従って行われています。試薬、機器、手技などは適宜ご自身のラボの方法に準じて使用し、操作を行ってください。

1. 準備する試薬

  1. 10x 細胞溶解バッファー (Cell Lysis Buffer 製品番号 ab152163
    -使用時に PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride) を最終濃度 1 mM になるように添加する。*1
    -使用時にプロテアーゼ・インヒビター・ミックスを添加する。*2
  2. 2x Laemmli サンプル・バッファー (pH 6.8)*3
  3. TBST (TBS - 0.1 % Tween-20)*4
  4. 5 % スキムミルク*5
  5. 5% BSA*6
  6. HRP 標識二次抗体溶液*7
  7. 化学発光試薬 (フィルムあるいはイメージング機器に適したもの)

2.1. 接着細胞のサンプル調製

  1. 90 % コンフルエントの細胞を準備する。
  2. 培地を取り除き、細胞を TBS で 2 回洗浄する。
  3. 1x 細胞溶解バッファーを適量添加する (例:T175 フラスコに 3 ml 添加)。
  4. エッペンドルフ・チューブに移し、10 – 15 秒間超音波処理する。
  5. 4 °C、14,000 rpm で 10 分間遠心し、上清を除く。

2.2. 浮遊細胞のサンプル調製

  1. 細胞をゆっくりピペッティングしながらコニカル・チューブに移し、1,000 rpmで 10 分間遠心する。
  2. 上清を除き、TBS で 2 回洗浄する。
  3. 1x 細胞溶解バッファーを適量添加する (例:1 x 10⁷ cell あたり 1 ml 添加)。
  4. 10 – 15 秒間超音波処理する。
  5. 4 °C、14,000 rpm で 10 分間遠心する。
  6. 50 μl 程度の液を採取し、タンパク質濃度を定量する。
  7. タンパク質の最終濃度が 1 mg/ml となるように細胞ライゼート溶液を加えた後、同等量の 2x Laemmli サンプル・バッファーを添加する。
  8. 100 ℃ で 5 分間煮沸する。その後サンプルを 26 G 針に通してクロマチンを剪断する。*8
  9. 分子量マーカーを SDS-PAGE 用ゲルの 1 ウェルに添加し、10 - 20 μg ずつ各ウェルに等量のサンプルを添加する。
  10. 電気泳動を行った後、ゲルからメンブレンに転写する。*9

3. ウエスタン・ブロッティング

  1. ブロッキング: メンブレンを 5 % BSA または 5 % スキムミルクに浸し、ローテーターなどで攪拌しながら室温で 1 時間、または 4 °C で一晩反応させる。
  2. 一次抗体反応: メンブレンを 5 % BSA または 5 % スキムミルクで希釈した一次抗体溶液*10に浸し、ローテーターなどで攪拌しながら 4 °C で一晩、または室温で 2 時間反応させる。
  3. メンブレンを TBST に浸し、シェーカー上で 5 分間洗浄する。これを 3 回行う。
  4. 二次抗体反応: メンブレンを HRP 標識二次抗体溶液に浸し、ローテーターなどで攪拌しながら室温で 1 – 2 時間反応させる。
  5. メンブレンを TBST に浸し、シェーカー上で 5 分間洗浄する。これを 3 回行う。
  6. シグナル検出: TBS ですすいだ後、化学発光試薬を添加して反応させる。
  7. 余分な化学発光試薬を取り除き、メンブレンをラップや透明シートで覆う。
  8. 暗室でシグナルを検出する。

*1ストック溶液として 100 mM PMSF を用意しておくと便利
*21x プロテアーゼ・インヒビター・ミックスの組成 : 2 mM AEBSF, 1 mM EDTA, 130 μM bestatin, 14 μM E-64, 0.3 μM aprotinin
*32x Laemmli サンプル・バッファーの組成 : 62.5 mM Tris-HCl, 25 % glycerol, 2 % SDS, 0.01 % Bromophenol Blue, 710 mM beta-mercaptoethanol (pH 6.8)
*4TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH7.6) に最終濃度 0.1% となるよう Tween-20 を添加
*525 g のスキムミルクを 500 ml TBST に溶解
*625 g の BSA を 500 ml TBSTに溶解
*7HRP 標識ヤギ抗ウサギ IgG (VeriBlot for IP secondary antibody (HRP) 製品番号 ab131366) を、5 % BSA または 5 % スキムミルクで 1 : 500 ~ 100,000 倍程度に希釈
*8サンプルをすぐに使わない場合は、凍結融解による劣化を避けるために 50 – 100 μl 程度に分注してから -20 °C で保存する。凍結保存したサンプルを融解する場合には、37 °C の湯煎で素早く溶解する。その後14,000 回転で 5 分間遠心して沈殿を除く。
*9ゲルからメンブレンへの転写の際には、気泡を完全に取り除くこと。またメンブレンは乾燥させないこと。
*10一次抗体の希釈濃度に関してはデータシートなどを参照のこと。

ウエスタン・ブロッティング関連リンク


技術情報一覧

FAQ

Trouble
shooting

10 のポイント

コントロール

蛍光 WB

製品情報

RabMAb
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免疫組織染色 RabMAb® 標準プロトコール

ウサギ・モノクローナル抗体 RabMAb® のパラフィン包埋切片を用いた免疫組織染色(Immunohistochemistry; IHC)の性能確認はアブカムのラボにおいて、下記のプロトコールに従って行われています。試薬、機器、手技などは適宜ご自身のラボの方法に準じて使用し、操作してください。

1. 準備する試薬

  1. キシレン
  2. エタノール(無水、組織学グレード)100 %、95 %、70 %、50 %
  3. TBST : 0.1 % Tween-20 / TBS - Tris Buffered Saline (pH 7.6)
  4. 蒸留水(dH₂O)
  5. 抗原賦活化溶液 : 0.01 M クエン酸ナトリウム・バッファー(pH 6.0)*1
  6. 3 % 過酸化水素水(H₂O₂)
  7. ブロッキング溶液 : 10 % 血清 / PBS(血清は使用する HRP 標識二次抗体の免疫動物種の血清とする)
  8. 一次抗体希釈液 : 5 % 血清 / PBS(血清は使用する HRP 標識二次抗体の免疫動物種の血清とする)
  9. DAB 基質溶液およびヘマトキシリン溶液
  10. 封入剤

2. 操作手順

2.1. 脱パラフィン / 再水和

  1. スライドを 65 ℃ のオーブンで 1 時間加熱する。
  2. キシレンで 3 分間 2 回洗浄し、その後 100 % エタノールで 3 分間 2 回リンスする。次いで 95 % エタノール、70 % エタノール、50 % エタノール、30 % エタノール、TBST の順にそれぞれ 3 分間ずつシェーカー上で洗浄する。

2.2 抗原賦活化*2

  1. 500 ml の蒸留水を装置(抗原賦活化装置または圧力釜)に加える。
  2. スライドを抗原賦活化溶液の入った容器に入れ、その容器を装置にセットする。
  3. 125 ℃ で 30 秒間、続いて 90 ℃ で 10 秒間、加熱する。
  4. スイッチを切り、室温で 10 ~ 20 分間冷却する。
  5. スライドを取り出し、TBST でリンスする。

2.3. 染色

  1. スライドを TBST に浸し、シェーカー上で 3 分間洗浄する。
  2. スライドに 3 % 過酸化水素水を滴下して 5 分間作用させ、組織内在性のペルオキシダーゼを不活化する。
  3. スライドを TBST に浸し、シェーカー上で 3 分間洗浄する。これを 3 回繰り返す。
  4. スライドをブロッキング溶液に浸し、室温で 1 時間ブロッキングする。
  5. 一次抗体希釈液を用いて一次抗体を希釈する(希釈倍率はデータシートなどを参照すること)。
  6. スライドに希釈した一次抗体溶液を滴下し、湿度を保持できるチャンバー内にて 4 ℃ 一晩反応させる。
  7. スライドを TBST に浸し、シェーカー上で 3 分間洗浄する。これを 3 回繰り返す。
  8. ブロッキング溶液を用いて HRP 標識二次抗体を希釈する(希釈倍率はデータシートなどを参照すること)。
  9. スライドに希釈した二次抗体溶液を滴下し、室温で 30 分間反応させる。
  10. スライドを TBST に浸し、シェーカー上で 5 分間洗浄する。これを 3 回繰り返す。
  11. スライドに用事調製した DAB 基質溶液を滴下し、発色反応を行う*3。発色は通常 1 分間ほどで完了する。
  12. スライドを蒸留水で洗浄する。
  13. スライドにヘマトキシリン溶液を滴下し、対比染色を行う*3。染色は通常 10 秒間ほどで完了する。
  14. スライドを蒸留水で洗浄する。
  15. スライドを 100 % エタノールで 3 分間ずつ 2 回洗浄し、次いでキシレンで 3 分間ずつ 2 回リンスして脱水する。
  16. 封入剤を用いて封入する*3。

*10.01 M クエン酸ナトリウム・バッファー(pH 6.0)の調製法
10 X ストック溶液の調製 : 1000 mL の蒸留水にクエン酸三ナトリウム二水和物 (C₆H₅Na₃O₇・2H₂O) 29.4 g を加えて溶解させた後、5 mL の Tween-20 を加える。
1 X 抗原賦活化溶液の調製 : 200 mL の 10x ストック溶液と 1800 mL の蒸留水を混ぜ、pH を 6.0 に合わせる。
*2ここでは熱処理抗原賦活化装置(Decloaking chamber)や 圧力釜(Pressure cooker)などを用いた方法をご紹介していますが、温度センサー付のウォーターバスや電子レンジなどを用いる方法もあります。いずれの場合でも、使用する機器の使用法に従って操作を行ってください。
*3DAB による発色反応、ヘマトキシリンによる対比染色、封入剤による封入は、それぞれ使用する試薬の使用法に従って操作を行ってください。

ご質問がありましたら、テクニカル・サポートまでメール technical@abcam.co.jp または電話(03-6231-0940)でお問い合わせください。

トラブルシューティング、FAQ、Webinar など、アブカムのウェブサイト上の技術情報を、ウェスタンブロット、免疫組織染色、フローサイトメトリーなどのアプリケーションごとにまとめた、便利なアプリケーション別技術情報のページをぜひご活用ください。

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チミジンアナログであるブロモデオキシウリジン (BrdU) は、細胞周期の S 期において新たに合成された DNA に取り込まれます。こうして BrdU が取り込まれた (BrdU でラベルされた) DNA は、抗 BrdU 抗体で検出することができるため、抗 BrdU 抗体は DNA 複製を行う増殖細胞の検出ツールとなり、増殖細胞数の計測や形態の観察などの経時的実験系や、増殖細胞特異的な抗原の解析など、多様な実験に応用できます

サンプルの調製

  • 30~50 μm 厚のゼラチン包埋組織切片
  • 30~50 μm 厚の OCT コンパウンド包埋組織切片
  • 培養細胞

一般的なプロトコール

  1. in vitro ラベルの場合:サンプルを 4% パラホルム・アルデヒド (PFA) にて、4℃ 30 分間の固定処理を行う。
    in vivo ラベルの場合:還流固定の後摘出したサンプルを、さらに 4% PFA で室温 2 時間処理する。
  2. 固定処理後 0.1M PBS (pH7.4) - 1% Triton X-100 にて 5 分ずつ 3 回洗浄する。
  3. サンプルを 1N HCl 中にて氷上 10 分間インキュベートし、DNA 変性処理を行う。
  4. サンプルを 2N HCl 中にて室温 10 分間インキュベートし、その後 37℃ 20分間インキュベートする。
  5. 塩酸を洗浄後、すぐに 0.1M ホウ酸バッファーを加え室温にて 12 分間インキュベートする。
  6. サンプルを0.1M PBS (pH7.4) - 1% Triton X-100 にて室温で 5 分、3 回洗浄する。
  7. ブロッキング溶液として 5% 正常ヤギ血清-1M グリシンを加えた 0.1M PBS (pH7.4) - 1% Triton X-100 中で 1 時間インキュベートする。そして抗 BrdU 抗体(および多重染色用抗体) 溶液にて室温で一晩インキュベートする。
  8. インキュベート後、サンプルを 0.1M PBS (pH7.4) - 1% Triton X-100 で室温にて 5 分ずつ 3 回洗浄する。
  9. HRP 標識や蛍光標識などの二次抗体を、それぞれ製品の使用法に従い反応させる。
注1. 確認されている限り、酸による処理は抗体の反応性に影響は及ぼしません。
注2. 切片の厚みにより反応時間を変える必要はありません。

実験例


図 1 in vitro で BrdU でラベルされた増殖中の細胞。HRP 標識二次抗体と DAB を用いて核を染色。スケールバー = 100 μm

図 2 BrdU ラベル後移植された細胞。抗体 ab1893 を TRITC 標識二次抗体を用いて染色。スケールバー = 100 μm

図 3 生体に BrdU を投与することによりラベルされた細胞。BrdU ラベルされた神経幹細胞が、頸部脊髄損傷部位に注入移植された後、注入地点より体軸方向に移動して脊髄背腹軸全体に分布したことが分かる。TRITC 標識二次抗体を用いて染色。スケールバー = 500 μm

参照文献

Chu K, Kim M, Chae SH, Jeong SW, Kang KS, Jung KH, Kim J, Kim YJ, Kang L, Kim SU, Yoon BW (2004) Distribution and in situ proliferation patterns of intravenously injected immortalized human neural stem-like cells in rats with focal cerebral ischemia. Neurosci Res 50:459-465.

Gage FH (2000) Mammalian neural stem cells. Science 287:1433-1438.

Hahn CG, Han LY, Rawson NE, Mirza N, Borgmann-Winter K, Lenox RH, Arnold SE (2005) In vivo and in vitro neurogenesis in human olfactory epithelium. J Comp Neurol 483:154-163.

Nieoullon V, Belvindrah R, Rougon G, Chazal G (2005) mCD24 regulates proliferation of neuronal committed precursors in the subventricular zone. Mol Cell Neurosci 28:462-474.

 

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