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フローサトメトリー RabMAb 標準プロトコール

ウサギ・モノクローナル抗体 RabMAb® のフローサイトメトリー(Flowcytometry; FCM, FlowCyt)の性能確認はアブカムのラボにおいて、下記のプロトコールに従って行われています。試薬、機器、手技などは適宜ご自身のラボの方法に準じて使用し、操作を行ってください。

1. 準備する試薬

  1. PBS:ダルベッコ PBS
  2. ブロッキング溶液:0.5 % BSA / PBS
  3. 2 % パラホルムアルデヒド:パラホルムアルデヒドを 70 ℃ に加熱したダルベッコ PBS に溶解させる(実験ごとに用時調製)
  4. 細胞透過溶液:BD Biosciences社 FACS permeabilizing solution カタログ番号 340973
  5. 蛍光標識二次抗体:一次抗体の動物種および必要とする波長に適した蛍光標識二次抗体を選択すること

2. 操作手順

  1. 1 サンプルあたり 1 x 106 個の細胞を準備する。
  2. 細胞をブロッキング溶液で 1 回洗浄する。
  3. 2 % パラホルムアルデヒドを加え、室温で 10 分間インキュベーションして細胞を固定する。
  4. 細胞をブロッキング溶液で 1 回洗浄する。
  5. 0.5 ml の細胞透過溶液を加え、室温で 10 分間作用させる。
  6. 細胞をブロッキング溶液で 1 回洗浄する。
  7. 細胞にブロッキング溶液を新たに加え、室温で 30 分間ブロッキングする。
  8. 希釈した一次抗体を細胞に加え、室温で 30 分間反応させる。希釈濃度はデータシートなどを参照すること。
  9. 細胞をブロッキング溶液で 2 回洗浄する。
  10. 蛍光二次抗体を加え、室温で 30 分間反応させる。希釈濃度はデータシートなどを参照すること。
  11. 細胞をブロッキング溶液で 2 回洗浄する。
  12. 細胞を PBS で再懸濁し、フローサイトメーターに供する。

※ 細胞懸濁液中に細胞魂があるままフローサイトメーターに供すると、ラインに細胞が詰まる場合がある。細胞魂がある場合には、細胞懸濁液をセルストレーナーまたはメッシュに通してから使用すること。
※サンプルは 1 % パラホルムアルデヒド溶液に浸し、4 ℃ で一晩保存が可能。

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