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免疫細胞染色 RabMAb 標準プロトコール

ウサギ・モノクローナル抗体 RabMAb® の免疫細胞染色 (Immunocytochemistry; ICC) の性能確認はアブカムのラボにおいて、下記のプロトコールに従って行われています。試薬、機器、手技などは適宜ご自身のラボの方法に準じて使用し、操作を行ってください。

1. 準備する試薬

  1. PBST 洗浄バッファー (0.1 % Tween-20 / ダルベッコ PBS)
  2. 2 % パラホルムアルデヒド *1
  3. 0.1 % Triton X-100
  4. ブロッキング溶液 *2
  5. ブロッキング溶液 : 10 % 血清 / PBS (血清は使用する 蛍光標識二次抗体の免疫動物血清とする)
  6. 一次抗体希釈液 : 5 % 血清 / PBS (血清は使用する 蛍光標識二次抗体の免疫動物血清とする)
  7. 封入剤 (蛍光染色用)
  8. アセトン

2. 操作手順

2.1 細胞の準備

  1. 細胞培養は、カバースリップ付のチャンバー・スライド、あるいは 6 ウェルプレートで行う。細胞数はコンフルエントの 80 % を超えないこと。

2.2 細胞の固定

  1. 容器から培地を取り除き、細胞を PBST 洗浄バッファーで 1 回洗浄する。
  2. 2 % パラホルムアルデヒドで 20 分間固定する。細胞によっては (HeLa など)、アセトンを -20 ℃ 5 分間反応させ、固定と透過処理を同時に行う。この場合、次のステップとして 2.2-5 に進む。
  3. 細胞を PBST 洗浄バッファーで 2 回洗浄する。
  4. 0.1 % Triton X-100 で 5 分間透過処理する。
  5. 細胞を PBST 洗浄バッファーで 2 回洗浄する。

2.3 ブロッキング

  1. ブロッキング溶液を加え、室温 1 時間、あるいは 4 ℃ 一晩反応させ、ブロッキングする。

2.4 染色

  1. 一次抗体をブロッキング溶液で希釈する。希釈濃度に関しては一次抗体のデータシートを参照のこと。
  2. 希釈した一次抗体を細胞に加えて 4 ℃で一晩インキュベートする。
  3. 細胞を PBST 洗浄バッファーで 2 回洗浄する。
  4. PBS で希釈した二次抗体を細胞に加え、暗所で室温 45 分間インキュベートする。希釈濃度に関しては二次抗体のデータシートを参照のこと。
  5. 細胞を PBST 洗浄バッファーで 2 回洗浄する。
  6. 300 nM DAPI を暗所で室温 5 分間インキュベートし、核を対比染色する。
  7. 細胞を PBST 洗浄バッファーで 3 回洗浄する。
  8. 封入剤で封入する。反応後のスライドはなるべく暗所で扱う。また、スライドの保管も暗所で行う。

*1 パラホルムアルデヒドを 70 ℃ に加熱したダルベッコ PBS に溶解させる (実験ごとに用時調製)。
*2 ダルベッコ PBS に二次抗体のホスト動物に由来する血清を 10 % 加えて調製する。

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