Welcome to the Abcam blog

ウエスタン・ブロッティング RabMAb 標準プロトコール

ウサギ・モノクローナル抗体 RabMAb® のウエスタン・ブロッティング (Western blotting; WB) における性能確認はアブカムのラボにおいて、下記のプロトコールに従って行われています。試薬、機器、手技などは適宜ご自身のラボの方法に準じて使用し、操作を行ってください。

1. 準備する試薬

  1. 10x 細胞溶解バッファー (Cell Lysis Buffer 製品番号 ab152163
    -使用時に PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride) を最終濃度 1 mM になるように添加する。*1
    -使用時にプロテアーゼ・インヒビター・ミックスを添加する。*2
  2. 2x Laemmli サンプル・バッファー (pH 6.8)*3
  3. TBST (TBS - 0.1 % Tween-20)*4
  4. 5 % スキムミルク*5
  5. 5% BSA*6
  6. HRP 標識二次抗体溶液*7
  7. 化学発光試薬 (フィルムあるいはイメージング機器に適したもの)

2.1. 接着細胞のサンプル調製

  1. 90 % コンフルエントの細胞を準備する。
  2. 培地を取り除き、細胞を TBS で 2 回洗浄する。
  3. 1x 細胞溶解バッファーを適量添加する (例:T175 フラスコに 3 ml 添加)。
  4. エッペンドルフ・チューブに移し、10 – 15 秒間超音波処理する。
  5. 4 °C、14,000 rpm で 10 分間遠心し、上清を除く。

2.2. 浮遊細胞のサンプル調製

  1. 細胞をゆっくりピペッティングしながらコニカル・チューブに移し、1,000 rpmで 10 分間遠心する。
  2. 上清を除き、TBS で 2 回洗浄する。
  3. 1x 細胞溶解バッファーを適量添加する (例:1 x 10⁷ cell あたり 1 ml 添加)。
  4. 10 – 15 秒間超音波処理する。
  5. 4 °C、14,000 rpm で 10 分間遠心する。
  6. 50 μl 程度の液を採取し、タンパク質濃度を定量する。
  7. タンパク質の最終濃度が 1 mg/ml となるように細胞ライゼート溶液を加えた後、同等量の 2x Laemmli サンプル・バッファーを添加する。
  8. 100 ℃ で 5 分間煮沸する。その後サンプルを 26 G 針に通してクロマチンを剪断する。*8
  9. 分子量マーカーを SDS-PAGE 用ゲルの 1 ウェルに添加し、10 - 20 μg ずつ各ウェルに等量のサンプルを添加する。
  10. 電気泳動を行った後、ゲルからメンブレンに転写する。*9

3. ウエスタン・ブロッティング

  1. ブロッキング: メンブレンを 5 % BSA または 5 % スキムミルクに浸し、ローテーターなどで攪拌しながら室温で 1 時間、または 4 °C で一晩反応させる。
  2. 一次抗体反応: メンブレンを 5 % BSA または 5 % スキムミルクで希釈した一次抗体溶液*10に浸し、ローテーターなどで攪拌しながら 4 °C で一晩、または室温で 2 時間反応させる。
  3. メンブレンを TBST に浸し、シェーカー上で 5 分間洗浄する。これを 3 回行う。
  4. 二次抗体反応: メンブレンを HRP 標識二次抗体溶液に浸し、ローテーターなどで攪拌しながら室温で 1 – 2 時間反応させる。
  5. メンブレンを TBST に浸し、シェーカー上で 5 分間洗浄する。これを 3 回行う。
  6. シグナル検出: TBS ですすいだ後、化学発光試薬を添加して反応させる。
  7. 余分な化学発光試薬を取り除き、メンブレンをラップや透明シートで覆う。
  8. 暗室でシグナルを検出する。

*1ストック溶液として 100 mM PMSF を用意しておくと便利
*21x プロテアーゼ・インヒビター・ミックスの組成 : 2 mM AEBSF, 1 mM EDTA, 130 μM bestatin, 14 μM E-64, 0.3 μM aprotinin
*32x Laemmli サンプル・バッファーの組成 : 62.5 mM Tris-HCl, 25 % glycerol, 2 % SDS, 0.01 % Bromophenol Blue, 710 mM beta-mercaptoethanol (pH 6.8)
*4TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH7.6) に最終濃度 0.1% となるよう Tween-20 を添加
*525 g のスキムミルクを 500 ml TBST に溶解
*625 g の BSA を 500 ml TBSTに溶解
*7HRP 標識ヤギ抗ウサギ IgG (VeriBlot for IP secondary antibody (HRP) 製品番号 ab131366) を、5 % BSA または 5 % スキムミルクで 1 : 500 ~ 100,000 倍程度に希釈
*8サンプルをすぐに使わない場合は、凍結融解による劣化を避けるために 50 – 100 μl 程度に分注してから -20 °C で保存する。凍結保存したサンプルを融解する場合には、37 °C の湯煎で素早く溶解する。その後14,000 回転で 5 分間遠心して沈殿を除く。
*9ゲルからメンブレンへの転写の際には、気泡を完全に取り除くこと。またメンブレンは乾燥させないこと。
*10一次抗体の希釈濃度に関してはデータシートなどを参照のこと。

ウエスタン・ブロッティング関連リンク


技術情報一覧

FAQ

Trouble
shooting

10 のポイント

コントロール

蛍光 WB

製品情報

RabMAb
ポータル

コメント (承認されるまでコメントは表示されません)