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免疫組織染色 RabMAb® 標準プロトコール

ウサギ・モノクローナル抗体 RabMAb® のパラフィン包埋切片を用いた免疫組織染色(Immunohistochemistry; IHC)の性能確認はアブカムのラボにおいて、下記のプロトコールに従って行われています。試薬、機器、手技などは適宜ご自身のラボの方法に準じて使用し、操作してください。

1. 準備する試薬

  1. キシレン
  2. エタノール(無水、組織学グレード)100 %、95 %、70 %、50 %
  3. TBST : 0.1 % Tween-20 / TBS - Tris Buffered Saline (pH 7.6)
  4. 蒸留水(dH₂O)
  5. 抗原賦活化溶液 : 0.01 M クエン酸ナトリウム・バッファー(pH 6.0)*1
  6. 3 % 過酸化水素水(H₂O₂)
  7. ブロッキング溶液 : 10 % 血清 / PBS(血清は使用する HRP 標識二次抗体の免疫動物種の血清とする)
  8. 一次抗体希釈液 : 5 % 血清 / PBS(血清は使用する HRP 標識二次抗体の免疫動物種の血清とする)
  9. DAB 基質溶液およびヘマトキシリン溶液
  10. 封入剤

2. 操作手順

2.1. 脱パラフィン / 再水和

  1. スライドを 65 ℃ のオーブンで 1 時間加熱する。
  2. キシレンで 3 分間 2 回洗浄し、その後 100 % エタノールで 3 分間 2 回リンスする。次いで 95 % エタノール、70 % エタノール、50 % エタノール、30 % エタノール、TBST の順にそれぞれ 3 分間ずつシェーカー上で洗浄する。

2.2 抗原賦活化*2

  1. 500 ml の蒸留水を装置(抗原賦活化装置または圧力釜)に加える。
  2. スライドを抗原賦活化溶液の入った容器に入れ、その容器を装置にセットする。
  3. 125 ℃ で 30 秒間、続いて 90 ℃ で 10 秒間、加熱する。
  4. スイッチを切り、室温で 10 ~ 20 分間冷却する。
  5. スライドを取り出し、TBST でリンスする。

2.3. 染色

  1. スライドを TBST に浸し、シェーカー上で 3 分間洗浄する。
  2. スライドに 3 % 過酸化水素水を滴下して 5 分間作用させ、組織内在性のペルオキシダーゼを不活化する。
  3. スライドを TBST に浸し、シェーカー上で 3 分間洗浄する。これを 3 回繰り返す。
  4. スライドをブロッキング溶液に浸し、室温で 1 時間ブロッキングする。
  5. 一次抗体希釈液を用いて一次抗体を希釈する(希釈倍率はデータシートなどを参照すること)。
  6. スライドに希釈した一次抗体溶液を滴下し、湿度を保持できるチャンバー内にて 4 ℃ 一晩反応させる。
  7. スライドを TBST に浸し、シェーカー上で 3 分間洗浄する。これを 3 回繰り返す。
  8. ブロッキング溶液を用いて HRP 標識二次抗体を希釈する(希釈倍率はデータシートなどを参照すること)。
  9. スライドに希釈した二次抗体溶液を滴下し、室温で 30 分間反応させる。
  10. スライドを TBST に浸し、シェーカー上で 5 分間洗浄する。これを 3 回繰り返す。
  11. スライドに用事調製した DAB 基質溶液を滴下し、発色反応を行う*3。発色は通常 1 分間ほどで完了する。
  12. スライドを蒸留水で洗浄する。
  13. スライドにヘマトキシリン溶液を滴下し、対比染色を行う*3。染色は通常 10 秒間ほどで完了する。
  14. スライドを蒸留水で洗浄する。
  15. スライドを 100 % エタノールで 3 分間ずつ 2 回洗浄し、次いでキシレンで 3 分間ずつ 2 回リンスして脱水する。
  16. 封入剤を用いて封入する*3。

*10.01 M クエン酸ナトリウム・バッファー(pH 6.0)の調製法
10 X ストック溶液の調製 : 1000 mL の蒸留水にクエン酸三ナトリウム二水和物 (C₆H₅Na₃O₇・2H₂O) 29.4 g を加えて溶解させた後、5 mL の Tween-20 を加える。
1 X 抗原賦活化溶液の調製 : 200 mL の 10x ストック溶液と 1800 mL の蒸留水を混ぜ、pH を 6.0 に合わせる。
*2ここでは熱処理抗原賦活化装置(Decloaking chamber)や 圧力釜(Pressure cooker)などを用いた方法をご紹介していますが、温度センサー付のウォーターバスや電子レンジなどを用いる方法もあります。いずれの場合でも、使用する機器の使用法に従って操作を行ってください。
*3DAB による発色反応、ヘマトキシリンによる対比染色、封入剤による封入は、それぞれ使用する試薬の使用法に従って操作を行ってください。

ご質問がありましたら、テクニカル・サポートまでメール technical@abcam.co.jp または電話(03-6231-0940)でお問い合わせください。

トラブルシューティング、FAQ、Webinar など、アブカムのウェブサイト上の技術情報を、ウェスタンブロット、免疫組織染色、フローサイトメトリーなどのアプリケーションごとにまとめた、便利なアプリケーション別技術情報のページをぜひご活用ください。

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