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二次抗体標識物の選び方

選ぶべき標識物の種類は

アプリケーションによって異なります。

A useful guide to choosing the correct conjugated secondary antibody for your scientific application.

例えばウエスタン・ブロッティングや ELISA で最も多く使用される二次抗体は、酵素標識抗体です。免疫組織染色も酵素をベースとした発色系を行うことが多いですが、感度を高めるためアビジン-ビオチン反応を応用したシグナル増幅系を採用する場合には、ビオチン標識抗体を用います。またフローサイトメトリーや蛍光細胞染色など、複数のターゲットを同時かつ個別に検出するアプリケーションにおいては、蛍光標識抗体を使用するのが一般的です。以上代表的な 3 種類の標識抗体について、解説します。

アプリケーション標識物
ウエスタン・ブロッティング酵素
ELISA酵素、ビオチン
免疫染色 IHCビオチン、酵素
免疫細胞染色 ICC蛍光色素
フローサイトメトリー蛍光色素

酵素標識抗体

酵素反応によって色素を発色させて可視で検出、あるいは吸光度計で定量する方法です。用いられる酵素には HRP (Horse Radish Peroxidase; 西洋ワサビペルオキシダーゼ)、AP (Alkaline Phosphatase; アルカリフォスファターゼ) などがあります。HRP は安価であること、安定性が高いこと、反応が早いことなどといった特長により、標識酵素として最も広く用いられています。AP はサンプルの内在性物質の影響を受けにくい、特異性が高いなどといった特長があります。各酵素の基質・発色剤とそれらの特徴を下表にまとめました。

酵素

基質・発色剤

適用*

長所

短所

HRP

水溶性色素
(TMB, ABTS, OPD 等)

ELISA

扱いが容易

光感受性がある

不溶性色素
(CN, AEC, DAB 等)

WB, SB, IHC

扱いが容易

血球やいくつかの組織でバックグランドが高い AP よりも呈色の安定性が低い

蛍光色素
(ADHP/resorufin)

ELISA

感度が高い

特別な検出機器が必要

化学発光

WB, SB, IHC

感度が高い

特別な検出機器が必要

AP

水溶性色素
(pNPP 等)

ELISA

直線性に優れる

安定性に欠ける

不溶性色素
(BCIP/NBT 等)

WB, SB, IHC

HRP よりも呈色の安定性が高い

核の対比染色を妨げる

蛍光色素
(4-MUP 等)

ELISA, IHC

感度が高い

特別な検出機器が必要

* WB: Western Blot, SB: Southern Blot, IHC: Immunohistochemistry, ELISA: Enzyme linkied immunosorbent assay

ビオチン標識抗体 (アビジン-ビオチン法)

アビジン Avidin とビオチン Biotin が酵素分子を含む複合体 (Complex) を形成することから、ABC 法とも呼ばれます。ビオチン標識二次抗体を加えたあと、ビオチンと強固に結合するアビジンまたはストレプトアビジンが標識された酵素を加えます。複合体が多数の酵素分子を含むため、シグナルが増幅されますので、免疫組織染色など高感度を必要とする実験で用いられています。各種キットが市販されていますので、詳細は各キットのデータシートをご参照ください。

蛍光標識抗体

蛍光色素分子は各分子に固有の励起 (吸収) 波長と蛍光波長を有しています。その特定の波長の光で励起されると、蛍光色素はエネルギーを蛍光という形でエネルギーを放出しますので、その蛍光をシグナルとして検出します。二つの蛍光色素が標識されたタンデムという特別な標識もあります。蛍光の原理については 「蛍光について」 をご参照ください。また代表的な蛍光色素 Alexa Fluor® についてはこちらをご参照ください。

「二次抗体標識物の選び方」、「イムノグロブリンフラグメント F(ab) / F(ab')2 とは何か?」、「Pre-adsorbed 抗体のメリット」 といった技術情報や、AlexaFluor 標識抗体といった製品情報など、アブカムの二次抗体に関する情報をまとめた二次抗体ポータルのページをぜひご活用ください。

トラブルシューティング、FAQ(よくある質問)、Webinar(オンライン・セミナー)など、アブカムのウェブサイト上の技術情報を、ウェスタンブロット、免疫組織染色、フローサイトメトリーなどのアプリケーションごとにまとめた、便利なアプリケーション別技術情報のページをご活用ください。

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