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1. 蛍光発光の原理
2. タンデム蛍光発光の原理
3. 主な蛍光色素の波長

1. 蛍光発光の原理

How does fluorescence work?

1. 蛍光色素分子が、蛍光顕微鏡やフローサイトメーターからの光 （電磁波） のエネルギーを吸収すると、分子はエネルギー的に安定な基底状態から、高いエネルギーを持った不安定な励起状態に遷移します。
2. 励起状態に遷移させるような波長は蛍光色素によって固有であり、これを励起波長と呼びます。
3. 励起状態に遷移した分子は、過剰のエネルギーを熱や振動として一部放出した後、最終的に蛍光という形でエネルギーを放出しながら低いエネルギーの基底状態に戻ります。放出されるエネルギー量は蛍光色素によって固有のもので、そのエネルギー量により蛍光波長、すなわちその色素固有の色調が決まります。ただし、蛍光の色調は溶媒をはじめとした周囲の環境に影響を受けやすいことにご注意ください。

2. タンデム蛍光発光の原理

How do Tandem Dyes work?

1. タンデム蛍光標識は蛍光共鳴エネルギー移動 （FRET） の原理を用いています。FRET とは、近接 （1～数nm） した 2 種類の蛍光分子間で、電子の共鳴によりエネルギーが直接移動する現象です。ある分子 （ドナー） の蛍光スペクトルともう一方の分子 （アクセプター） の励起スペクトルに重なりがある場合、励起状態に遷移したドナー分子のエネルギーは直接発光に用いられず、アクセプター分子の励起に用いられるという現象です。
2. ドナー分子が、蛍光顕微鏡やフローサイトメーターからの光（電磁波）のエネルギーを吸収すると、分子はエネルギー的に安定な基底状態から、高いエネルギーを持って不安定な励起状態に遷移します。
3. 励起状態にあるドナー分子のエネルギーが、電子の共鳴によってアクセプター分子に移動します。
4. 励起状態に遷移したアクセプター分子は、蛍光という形でエネルギーを放出しながら低いエネルギーの基底状態に戻ります。放出されるエネルギー量は蛍光色素によって固有のもので、そのエネルギー量により蛍光波長、すなわちその色素固有の色調が決まります。

タンデム蛍光標識抗体は PE と Cy5 のような組み合わせの蛍光色素が 2 種類標識されています。標識された 2 種類の分子は、エネルギー移動ができるぐらい十分近いところに位置しています。まず特定波長の光でドナー分子 PE を励起します （この波長の光ではアクセプター分子 Cy5 は励起されません）。ドナー分子が吸収したエネルギーは、電子の共鳴によってアクセプター分子 Cy5 に移動します。励起されたアクセプターは、吸収したエネルギーを蛍光として放出します。

PE-Cy5 タンデム蛍光標識抗体の場合、励起波長は PE の励起波長である 565nm、蛍光波長は Cy5 の蛍光波長である 670nm になります。

以上の解説の英語バージョンが PDF ファイルでダウンロードできます。 こちらからどうぞ。

3. 主な蛍光色素の波長