Rabbit anti-Sheep IgG H&L (FITC) secondary antibody (ab6743)

Finalmente como abes he comprado ab8940 anti-human serum albumin

y ab6743 anti sheep, la primera prueba no ha sido demasiado exitosa,

por lo que quería preguntar, si teneis algun protocolo de refencia.

Muchas gracias por vuestra atención

ANSWER:

Gracias por tu respuesta.

No tenemos un protocolo concreto para el uso de este anticuerpo mediante immunohistoquímica, sino protocolos generales que pueden servir de guía para los distintos ensayos.

Te adjunto el link del protocolo de immunohistoquímica para secciones incluidas en parafina:

http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11384

Así como el “recetario” de los distintos pasos a seguir:

http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=13046

También te pueden resultar útiles los consejos para tratar los posibles problemas que pueden darse a lo largo del ensayo:

http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11467

Las únicas recomendaciones concretas para el uso de estos anticuerpos es utilizar como agente de bloqueo suero de conejo (especie de procedencia del secundario) y usar el primario a una dilución de 1/1000. Quizás te ayude echar un vistazo al Abreview publicado por otro usuario del anticuerpo ab8940 para comprobar en qué condiciones usó el anticuerpo.

Es importante también usar siempre controles positivos para ayudar a determinar el origen de los posibles problemas, así como llevar a cabo controles no primarios (incubando únicamente el secundario).

En cualquier caso, ambos anticuerpos están cubiertos por nuestra garantía Abpromise, y si siguieras teniendo problemas con ellos te ruego que nos contactes para ayudarte a resolverlos.

Muchas gracias por tus comentarios.
Como sistema de recuperación antigénica utilizo normalmente citrato sódico y microondas.
Me comentas lo de usar suero de mismo secundario, pero en este caso no seri sheep?

Muchas gracias

ANSWER:

Gracias por tu respuesta.
Te confirmo que ab53435 solo se ha testado en secciones congeladas. No tenemos, pues, ninguna evidencia de que vaya a detectar el epítopo en secciones incluidas en parafina.
Así pues, puedes optar por testarlo en esta aplicación, indicándomelo previamente para que yo te envíe el código canjeable por un anticuerpo gratuito, u optar por usar ab8940.
Si eliges la última opción te aconsejo que uses el método de recuperación antigénica que te suele funcionar. Yo particularmente aconsejo Tris EDTA en microondas, optimizando el tiempo de recuperación, es decir, probando a varios tiempos, a partir de un minuto, y no más de 20, para evitar dañar la morfología del tejido.
Como agente de bloqueo, la recomendación es usar suero de la misma especie en la que se generó el secundario, para evitar uniones inespecíficas de éste. Si utilizas el Rabbit anti-Sheep IgG H&L (FITC) secondary antibody (ab6743), lo ideal sería usar suero de conejo.
Espero haberte ayudado. Recuerda que si optas por probar ab53435 en IHC-P, el código debe emitirse en primer lugar, por lo que antes de hacer el pedido te pido que me lo indiques para enviarte dicho código.
Si tienes alguna otra consulta, no dudes en volver a contactarnos.

I have received ab6743 from you and have been using it as the secondary ab against a sheep anti-histone ab (Biogenesis catalog #4974-8060). I am testing N18 cells (an adherent mouse neuroblastoma cell line) to determine if histones are ever expressed on the cell surface. (Likely an artifact but the point of doing this is to confirm that it's not true). For my first attempt I used the Cytofix/Cytoperm kit by Pharmingen to permeabalize the cells. A fraction of a percent of the cells lit up. I have done this experiment2 more times using 0.4% Triton x-100 (after paraformaldehdye fixation) to permeabalize cells. None of the cells have lit up. What do you recommend for permeabilization of adherrent cells? Also, have you confirmed your ab works in this type of experiment? or with the Biogenesis ab?

ANSWER:

We have no experience using this secondary antibody in this technique, so I am afraid that I cannot offer any specific advice. However, this Rabbit polyclonal to sheep IgG will certainly work in conjunction with a sheep primary.

I have received your antibodies, ab6743 and ab7834, and would like to know if they are stable in buffers containing 0.4% Triton X-100. I need to permeabilize cells and the protocol I intend to use calls for fixation with 4% paraformaldehyde in PBS followed by permeabilization with PBS containing 0.4% Triton X-100, 1% BSA and 4% normal serum. Will your antibodies be ok in this buffer?

Thanks,

Ron Knight

ANSWER:

Antibodies are usually stable in buffers containing triton-X. I've personally used antibodies in such buffers with no problems. Also, several automated IHC staining systems routinely use such surfactants in their buffer solutions. We have never actually tested ab6743 and 7834 in Triton-X containing buffers, but the odds are that they will be OK. Try a small amount for starters to make sure.